Ringförmige Mikrostrukturierung Zellchiralitätsassay: Eine In-vitro-Technik zur Bestimmung der multizellulären Chiralität basierend auf der Zellausrichtung auf ringförmigen Mikromustern

Um in vitro die Chiralität von Säugetierzellen zu bestimmen - die Links-Rechts-Verzerrung von Zellen, die sich unter beengten Bedingungen in einer Links- oder Rechtsausrichtung ausrichten - beginnen Sie mit speziell angefertigten, goldbeschichteten Objektträgern in einer medienhaltigen Multi-Well-Platte. Die Objektträger bestehen aus Mikromustern ringförmiger Inseln aus zelladhäsionsförderndem Fibronektin, die mit zelladhäsionsresistenten, selbstorganisierten Monoschichten verfüllt sind.

Als nächstes säen Sie ein geeignetes Volumen der Säugetierzellsuspension auf die Objektträger und inkubieren. Die Zellen adsorbieren an die Fibronektin-haltigen Ringmikromuster. Die umgebende selbstorganisierende Monolage verhindert eine unspezifische Zellanheftung außerhalb der Ringgrenzen.

Ersetzen Sie das Medium und entfernen Sie alle nicht angeschlossenen Zellen durch ein neues Medium. Geben Sie ein Aktin-interferierendes Medikament zu einem Satz Objektträger und inkubieren Sie.

Die anhaftenden Zellen vermehren sich, breiten sich aus und nehmen die Form der darunter liegenden Fibronektininseln an, während sie ihre Aktinfasern als Reaktion auf die räumlichen Signale neu organisieren, die die Zellmonoschicht eingrenzen und eine verzerrte Ausrichtung fördern.

Behandeln Sie nun die Objektträger mit Paraformaldehyd zur Zellfixierung. In der Phasenkontrastmikroskopie erscheinen die Zellen auf den Ringmikromustern als dunkle Bereiche mit hellen Konturen, die entsprechend ihrer bevorzugten Vorspannung ausgerichtet sind.

Berechnen Sie mithilfe der Software den Ausrichtungswinkel jeder Zelle als Abweichung von der Umfangsrichtung des Rings. Mittelwert zur Bestimmung der Chiralität von Säugetierzellen. Aktin-interferierende Zellen, die mit Medikamenten behandelt werden, können eine umgekehrte Chiralität aufweisen.

Bevor Sie die Zellen aussäen, erwärmen Sie das Medium und Trypsin in einem Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius temperiert wird.

Für eine bessere Zelladhäsion weichen Sie den gemusterten Objektträger in einer 12-Well-Platte mit Kulturmedien ein und erwärmen Sie ihn im Inkubator bei 37 Grad Celsius. Sobald die Zellen trypsinisiert sind, neutralisieren Sie die Zellen mit FBS-haltigen Medien. Pelletieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 100 x g und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in frischem Medium. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension, um eine Konzentration von 200.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung, die einen Goldobjektträger enthält. Schütteln Sie die Platte einige Male vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellaussaat zu erzielen, bevor Sie sie 15 Minuten lang inkubieren, um die Zellen zu adhäsieren. Nach 15 Minuten wird die Zellanhaftung unter dem Mikroskop überprüft und bei Bedarf noch einige Zeit inkubiert.

Sobald die Zellen anhaften, aspirieren Sie das Medium mit den nicht gebundenen Zellen aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 Milliliter frisches Kulturmedium hinzu. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang im Inkubator und überprüfen Sie die Konfluenz, um festzustellen, ob sich Chiralität gebildet hat.

Wenn die erforderliche Konfluenz erreicht ist, fixieren Sie die Zellen, indem Sie das Kulturmedium entfernen. Nach einmaligem Spülen mit PBS fügen Sie dem Objektträger 4% ige Paraformaldehydlösung hinzu und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie ihn erneut dreimal mit PBS spülen.

Um die Bilder aufzunehmen, verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit Kamerafunktion und erfassen Sie jeden Ring auf dem Objektträger mit hoher Auflösung.

Laden Sie für die Charakterisierung der Chiralität die MATLAB-Codedateien herunter. Fügen Sie den Codeordner und die Unterordner zum MATLAB-Pfad hinzu und öffnen Sie die Datei "ROI_selection.m". Wechseln Sie in Zeile 4 das Verzeichnis in den gewünschten Datenordner.

Ändern Sie die Bildgröße in Zeile 14, wobei die ersten beiden Ziffern die innere Kreisgröße des Rings darstellen, während die anderen beiden die äußere darstellen.

Um den interessierenden Bereich oder ROI in den Phasenkontrastbildern zu bestimmen, führen Sie den MATLAB-Code "ROI_selection.m" m aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Ziehen Sie das Auswahlquadrat manuell an den Ring und doppelklicken Sie dann auf das Bild, um die Auswahl zu bestätigen.

Nachdem Sie ROI aus allen Bildern im Ordner ausgewählt haben, wird eine ".mat"-Datei generiert, in der die ROI-Informationen für jedes Bild gespeichert werden. Öffnen Sie dann die Datei "Analysis_batch.m" und ändern Sie das Verzeichnis des Ordners, wie zuvor gezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Code "Analysis_batch.m" auszuführen und die Chiralität mehrerer zellulärer Ringmuster zu bestimmen.

Es wird eine "datatoexcel.txt"-Datei generiert, die zirkuläre Statistiken für jeden Ring sowie die Anzahl der im Uhrzeigersinn, nicht chiralen und gegen den Uhrzeigersinn gerichteten Ringe enthält.