Einzelmolekül-Pull-Down-Assay für die Proteinphosphorylierungsanalyse: Eine Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung in Zelllysat

Die Phosphorylierung bestimmter zellulärer Proteine ist wichtig für ihre biologische Funktion.

Um die Phosphorylierungsniveaus intakter Proteine mit einem Einzelmolekül-Pulldown-Assay zu quantifizieren, beginnen Sie mit der Entnahme eines Deckglases aus Glas mit einem Gitter-Array-Muster. Jedes Kompartiment ist mit biotinyliertem Polyethylenglykol oder PEG-basierten Linkern beschichtet, die mit normalem PEG abgesetzt sind, um eine sterische Behinderung während der Proteinbindung zu verhindern.

Behandeln Sie das Deckglas mit einem Reduktionsreagenz, um die Autofluoreszenz bei der Analyse zu minimieren. Überziehen Sie das Deckglas mit Neutravidinen - Biotin-bindenden Proteinen - und inkubieren Sie, damit sie biotinylierte PEG-Linker binden können.

Ergänzen Sie das Array mit spezifischen Anti-Target-Protein-Antikörpern. Jeder Antikörper enthält Biotin, das an seine Fc-Region gebunden ist, was dazu beiträgt, den Antikörper an das Neutravidin zu verankern, was zu einer Immobilisierung führt.

Fügen Sie nun das Zellkulturlysat hinzu, das verschiedene Proteine enthält, einschließlich der grün fluoreszenzmarkierten phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Varianten des Zielproteins, und