Einzelmolekül-Pull-Down-Assay für die Proteinphosphorylierungsanalyse: Eine Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung in Zelllysat

Die Phosphorylierung bestimmter zellulärer Proteine ist wichtig für ihre biologische Funktion.

Um die Phosphorylierungsniveaus intakter Proteine mit einem Einzelmolekül-Pulldown-Assay zu quantifizieren, beginnen Sie mit der Entnahme eines Deckglases aus Glas mit einem Gitter-Array-Muster. Jedes Kompartiment ist mit biotinyliertem Polyethylenglykol oder PEG-basierten Linkern beschichtet, die mit normalem PEG abgesetzt sind, um eine sterische Behinderung während der Proteinbindung zu verhindern.

Behandeln Sie das Deckglas mit einem Reduktionsreagenz, um die Autofluoreszenz bei der Analyse zu minimieren. Überziehen Sie das Deckglas mit Neutravidinen - Biotin-bindenden Proteinen - und inkubieren Sie, damit sie biotinylierte PEG-Linker binden können.

Ergänzen Sie das Array mit spezifischen Anti-Target-Protein-Antikörpern. Jeder Antikörper enthält Biotin, das an seine Fc-Region gebunden ist, was dazu beiträgt, den Antikörper an das Neutravidin zu verankern, was zu einer Immobilisierung führt.

Fügen Sie nun das Zellkulturlysat hinzu, das verschiedene Proteine enthält, einschließlich der grün fluoreszenzmarkierten phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Varianten des Zielproteins, und inkubieren Sie. Beide Varianten des Zielproteins werden von den Antikörpern eingefangen und bilden Komplexe. Waschen, um die ungebundenen Proteine zu entfernen.

Behandeln Sie diese Komplexe anschließend mit dem zweiten Satz roter fluoreszenzmarkierter Antikörper, die ausschließlich an die phosphorylierten Reste des Proteins binden und dem Komplex ein anderes Fluoreszenzsignal verleihen.

Bilden Sie das Array unter einem Fluoreszenzmikroskop ab und beobachten Sie es auf zwei unterschiedliche Fluoreszenzsignale. Die Kolokalisation beider Fluoreszenzsignale deutet auf das Vorhandensein von phosphorylierten Proteinen in der Probe hin.

Nehmen Sie die funktionalisierten Biotin-PEG-Arrays aus dem Gefrierschrank und äquilibrieren Sie sie auf Raumtemperatur. Legen Sie das Deckglas mit dem Array nach oben über eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale, die mit Siegelfolie ausgelegt ist. Jedes Quadrat des Arrays wird 4 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 Milligramm Natriumborhydrid und PBS inkubiert. Dreimal mit PBS waschen.

Inkubieren Sie anschließend 5 Minuten lang mit 0,2 Milligramm pro Milliliter NeutrAvidin in T50, gefolgt von dreimaligem Waschen mit T50-BSA. Wiederholen Sie die Inkubation mit 2 Mikrogramm pro Milliliter biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50-BSA für 10 Minuten, gefolgt von einem Waschen.

Tauen Sie zuerst das Lysat auf und mischen Sie es durch Pipettieren. 1 Mikroliter des Lysats in 100 Mikroliter eiskaltes T50-BSA/PPI verdünnen. Inkubieren Sie das Lysat 10 Minuten lang auf dem Array, gefolgt von einem Waschen. Bereiten Sie den AF647-konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper in eiskaltem T50-BSA/PPI vor und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang auf dem Array.

Einen Tropfen Öl auf das Ziel geben. Platzieren Sie das Nanogitter für die Bildgebung auf dem Tisch. Fokussieren Sie sich mit weißem Durchlicht auf das Gittermuster. Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern des Rasters. Stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind, und speichern Sie die Bildserie als "Fiducial".

Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein luftiges Muster zu erzeugen. Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern für die Verstärkungskalibrierung und speichern Sie das Bild als "Verstärkung". Nehmen Sie dann eine Serie von 20 Bildern für den Kameraversatz auf, indem Sie das gesamte Licht für die Kamera blockieren, und speichern Sie das Bild als "Hintergrund".

Um SiMPull-Bilder zu erhalten, reinigen Sie zunächst das Ölobjektiv und lagern Sie zusätzliches Öl auf das Objektiv auf. Befestigen Sie das Deckglas-Array auf dem Mikroskoptisch. Erfassen Sie Bilder für jede Probe, zuerst im dunkelroten Kanal, gefolgt von Fluorophoren mit niedrigerer Wellenlänge. Überprüfen Sie den Pufferstand alle 30 bis 45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf.