JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:55 Min. • July 8th, 2025
Um das Potenzial einer larviziden Testverbindung zu bewerten, beginnt ein Dopaminrezeptorantagonist unter Verwendung eines Larvenkontaktassays mit lebenden Mückenlarven in ihrem gewünschten Entwicklungs- oder Instarstadium in wässrigen Medien. Übertragen Sie die gleiche Anzahl der Larven in die Vertiefungen einer Multi-Well-Platte.
Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen durch entionisiertes Wasser, um Störungen durch Verunreinigungen zu vermeiden, die sich negativ auf die Larven auswirken könnten. Geben Sie zunehmende Konzentrationen der Testverbindung in die jeweiligen Vertiefungen.
Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um den Kontakt zwischen Larven und Testmasse zu erleichtern. Inkubieren Sie die Platte unter geeigneten Bedingungen.
Bei Kontakt mit den Larven dringt die Testverbindung in die Körperwand oder die äußerste Schicht ein und erreicht die Spiracles, Öffnungen des Trachealsystems, die mit den Ganglien - einer Ansammlung von Nervenzellen - verbunden sind, die das zentrale Nervensystem bilden.
Auf den Nervenzellen bindet die Testsubstanz an die sekundären Bindungsstellen von Dopaminrezeptoren, die an kritischen zellulären Prozessen beteiligt sind. Diese Bindung, selbst wenn der Neurotransmitter Dopamin an den Dopaminrezeptor gebunden ist, verhindert die Aktivierung des Rezeptors und die nachgeschaltete Signalübertragung, wodurch die Larvenentwicklung gestört wird und letztendlich zum Tod führt.
Notieren Sie die Anzahl der nicht reagierenden Larven, die sich nicht bewegen, in jeder Vertiefung zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Exposition der Testverbindung in unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindung.
Eine erhöhte Larvensterblichkeit mit zunehmender Konzentration deutet auf das larvizide Potenzial der Testsubstanz hin.
Beschriften Sie zunächst die Vertiefungen einer durchsichtigen 24-Well-Gewebekulturplatte. Verwenden Sie eine Analysenwaage, um die Testverbindung zu wiegen. Lösen Sie dann die Verbindung in sterilem, doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf, was zu einer 80-Millimolaren Stammlösung führt. Als nächstes verdünnen Sie die Stammlösung seriell mit doppelt destilliertem Wasser, um Arbeitsstofflösungen mit den gewünschten Konzentrationen herzustellen.
Es ist zu beachten, dass beim Einbringen der Larven in die Vertiefungen, beim Entfernen von überschüssigem Wasser und bei der Zugabe der Prüfchemikalie darauf geachtet werden muss, dass die Larven nicht physisch beschädigt werden. Eine Verletzung kann die Mortalität erhöhen und somit zu falsch positiven Ergebnissen führen oder den Assay ungültig machen.
Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit breiter Bohrung, um fünf Larven des dritten Stadiums in jede Vertiefung der Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine 1-Milliliter-Pipette, um das Wasser vorsichtig zu entfernen, und ersetzen Sie es durch die gewünschte Menge doppelt destilliertes Wasser.
Achten Sie darauf, die Larven beim Entfernen des Wassers nicht zu berühren. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass die Larven nicht austrocknen, und fügen Sie die Testchemie vorsichtig hinzu, indem Sie gegen die gegenüberliegende Seite der Kunststoffvertiefung pipettieren.
Geben Sie ein angemessenes Volumen der Testlösung in jede Vertiefung und drehen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte in eine Wachstumskammer und halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 Grad Celsius und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit ein.
Um die Bewegung der Larven zu überprüfen, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte. Wenn keine Bewegung beobachtet wird, berühren Sie die Larve vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher. Bewerten Sie die Larve als tot, wenn keine Reaktion bemerkt wird, und verwenden Sie ein Bewertungsblatt, um die Gesamtzahl der toten Larven in jeder Vertiefung zu den im Textprotokoll beschriebenen Zeitpunkten aufzuzeichnen.