JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:12 Min. • July 8th, 2025
Die Entfernung von fehlgefalteten Proteinen in der Zelle wird hauptsächlich durch das zelluläre Ubiquitin-Proteasom-System reguliert, wobei das Protein zuerst von Ubiquitin, einem kleinen regulatorischen Protein, erkannt und markiert und zur Hydrolyse und Clearance zum Proteasom, einem Multiproteinkomplex, transportiert wird.
Eine gestörte Aktivität des Ubiquitin-Proteosomen-Systems, ein häufiges Ereignis bei neurodegenerativen Erkrankungen, kann dazu führen, dass sich fehlgefaltete Proteine in den Zellen ansammeln und unlösliche Proteinaggregate mit zytotoxischer Wirkung bilden.
Um die Proteinaggregation in vitro zu visualisieren und zu quantifizieren, erhalten Sie eine Suspension von transduzierten Säugetierzellen - die ein fluoreszenzmarkiertes mutiertes Protein exprimieren, das eine fehlgefaltete Konformation mit exponierten hydrophoben Resten annimmt - in geeigneten Medien.
Pipettieren Sie steigende Konzentrationen eines Proteasom-Inhibitors in die Vertiefungen einer schwarzen Multi-Well-Platte, um die Hintergrundfluoreszenz während der Bildgebung zu minimieren. Säen Sie die Säugetierzellsuspension in die Vertiefungen. Inkubieren, damit die Zellen am Boden der Platte haften un
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