Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Die Entfernung von fehlgefalteten Proteinen in der Zelle wird hauptsächlich durch das zelluläre Ubiquitin-Proteasom-System reguliert, wobei das Protein zuerst von Ubiquitin, einem kleinen regulatorischen Protein, erkannt und markiert und zur Hydrolyse und Clearance zum Proteasom, einem Multiproteinkomplex, transportiert wird.

Eine gestörte Aktivität des Ubiquitin-Proteosomen-Systems, ein häufiges Ereignis bei neurodegenerativen Erkrankungen, kann dazu führen, dass sich fehlgefaltete Proteine in den Zellen ansammeln und unlösliche Proteinaggregate mit zytotoxischer Wirkung bilden.

Um die Proteinaggregation in vitro zu visualisieren und zu quantifizieren, erhalten Sie eine Suspension von transduzierten Säugetierzellen - die ein fluoreszenzmarkiertes mutiertes Protein exprimieren, das eine fehlgefaltete Konformation mit exponierten hydrophoben Resten annimmt - in geeigneten Medien.

Pipettieren Sie steigende Konzentrationen eines Proteasom-Inhibitors in die Vertiefungen einer schwarzen Multi-Well-Platte, um die Hintergrundfluoreszenz während der Bildgebung zu minimieren. Säen Sie die Säugetierzellsuspension in die Vertiefungen. Inkubieren, damit die Zellen am Boden der Platte haften und sich vermehren können.

Sobald sich der Proteasom-Inhibitor im Inneren befindet, bindet er an die proteolytischen Stellen des Proteasoms und blockiert dessen Aktivität, wodurch sich die exprimierten mutierten Proteine ansammeln, die dann über ihre freiliegenden hydrophoben Reste interagieren und zytoplasmatische Aggregate bilden, was schließlich zum Zelltod führt.

Fügen Sie einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff hinzu, um die Zellkerne zu färben. Stellen Sie sich die Platte vor. Die fluoreszierenden mutierten Proteinaggregate erscheinen im ungefärbten Zytoplasma dispergiert.

Vertiefungen mit höheren Proteasom-Inhibitor-Konzentrationen weisen ein höheres Verhältnis von Protein-Aggregatzahlen zu Zellzahl auf als Vertiefungen mit niedrigeren Proteasom-Inhibitor-Konzentrationen.

Für den Verbindungstransfer werden auf einer 384-Well-Lagerplatte aus Polypropylen serielle Verdünnungen von Verbindungen mit den standardmäßigen Verdünnungsreihen von 1 bis 3 hinzugefügt. Verteilen Sie dann mit einem Liquid Handler, der mit einem 384-Kapillarkopf ausgestattet ist, 0,25 Mikroliter Proteasom-Inhibitoren auf leere schwarze 384-Well-Assay-Platten mit flachem Boden. Dann säen Sie 1,5 x 10⁴ Zellen auf diese Platten. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Vor der Bildgebung der mit Proteasom-Inhibitoren behandelten Zelllinie werden 10 Mikroliter vorgewärmtes DMEM mit Färbelösung zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Starten Sie nach der Färbung die automatisierte Mikroskop-Betriebssoftware, indem Sie auf die Registerkarte "Mikroskop" klicken. Wählen Sie zuerst die Registerkarte "Konfiguration" und dann das 20X-Objektiv und den richtigen Plattentyp.

Um eine korrekte Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen zu ermöglichen, stellen Sie sicher, dass der "Kragen" auf dem Objektiv auf den richtigen Wert eingestellt ist.

Wählen Sie anschließend "Belichtung 1", stellen Sie die Fokushöhe auf "0 Mikrometer" ein und wählen Sie dann "Fokus". Sobald es fokussiert ist, belichten Sie Kamera 1.

Um die Belichtungsebene zu optimieren, passen Sie die Fokushöhe an und klicken Sie auf "Höhe nehmen". Ändern Sie die Belichtungszeiten in der Laserleistung für eine maximale Pixelintensität von ca. 3.000 und speichern Sie die Belichtungsparameter.

Wählen Sie die Registerkarte "Experimentdefinition". Erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout. Ziehen Sie als Nächstes das relevante Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Skewcrop-Datei und das Unterlayout per Drag & Drop. Speichern Sie dann das Experiment.

Wählen Sie abschließend die Registerkarte "Automatisches Experiment" und nehmen Sie Bilder auf. Wählen Sie bei 2-Kanal-Bildern zunächst den Softwarealgorithmus aus, um die primären Objekte wie Zellkerne, Zytosol und Aggregate zu segmentieren.