Annexin-V-Bindungsassay: Eine fluoreszenzbasierte Technik zur Identifizierung apoptotischer Erythrozyten durch Phosphatidylserin-Markierung

Bei bestimmten pathologischen Zuständen schrumpfen die Erythrozyten oder roten Blutkörperchen, begleitet von der Translokation des Membranphospholipids - Phosphatidylserin - vom inneren zum äußeren Membransegel, was zum programmierten Zelltod, der Eryptose, führt und eine Makrophagen-vermittelte Zellphagozytose auslöst.

Zur Messung der Ionophor-induzierten Eryptose in isolierten menschlichen Erythrozytenpopulationen mittels Annexin-V-Bindungsassay beginnen Sie mit Erythrozyten, die in einem glukosefreien Puffer suspendiert sind.

Glukosemangel induziert zellulären Stress und aktiviert die zytosolische Proteinkinase C, die anschließend Kalziumkanäle aktiviert und den Einstrom von Kalziumionen verursacht. Darüber hinaus werden Kaliumkanäle aktiviert, was zu Kaliumausfluss und Zellschrumpfung führt.

Fügen Sie als nächstes Kalziumionophor hinzu, das einen stabilen Komplex mit extrazellulären Kalziumionen bildet. Der Komplex erleichtert den zytosolischen Eintritt von Kalziumionen durch die Zellmembran und erhöht die intrazelluläre Kalziumkonzentration weiter. Dies wiederum aktiviert Scramblase - einen bidirektionalen Phospholipidtransporter -, der bei der Translokation von Phosphatidylserin vom inneren zum äußeren Zellmembransegel hilft, die Membranasymmetrie reduziert und Eryptose induziert.

Zentrifugieren Sie die mit Ionophoren behandelten Erythrozyten. Resuspendieren Sie die Zellen in einem kalziumhaltigen Bindungspuffer. Fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Annexin-V-Lösung zugeben.

Das Calcium-abhängige Phospholipid-bindende Protein Annexin V mit hoher Phosphatidylserin-Affinität bindet an die exponierten Phosphatidylserinreste auf der äußeren Zellmembran-Leaflet.

Trennen Sie die Erythrozytenpopulation unter Verwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung anhand der Annexin-V-Fluoreszenzintensität. Eryptotische Erythrozyten weisen eine höhere Annexin-V-Fluoreszenzintensität auf als gesunde Erythrozyten.

Verdünnen Sie 2 Milliliter des 5-fachen Annexin-V-Bindungspuffers in 8 Millilitern PBS, um 1-fachen Bindungspuffer zu erhalten. Resuspendieren Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Zellpellets in 1 Milliliter des 1X-Bindungspuffers.

Nehmen Sie 235 Mikroliter der Zellsuspensionen in den Bindungspuffer und geben Sie 15 Mikroliter Annexin V-Alexa Fluor 488 Konjugat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort.

Bei 700 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X Bindungspuffer, indem Sie das Zellpellet in 1,5 Millilitern des Bindungspuffers suspendieren und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 700 x g zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 250 Mikrolitern 1X-Bindungspuffer für durchflusszytometrische Messungen. Übertragen Sie nun 200 Mikroliter der Annexin V-gefärbten Erythrozyten in 1-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind.

Melden Sie sich bei der Durchflusszytometrie-Software an und klicken Sie auf die Schaltfläche "Neues Experiment". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Röhre", wählen Sie das "Globale Blatt" und wählen Sie "Analyse anwenden", um die Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 530 Nanometern zu messen.

Legen Sie die Anzahl der Zellen auf 20.000 fest, die für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse entnommen werden sollen. Wählen Sie das gewünschte Rohr aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Laden". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufzeichnen" für Vorwärts- und Seitenstreumessungen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Proben.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche "Probe" und klicken Sie auf "Chargenanalyse anwenden", um die Ergebnisdatei zu generieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche "Muster" und klicken Sie auf "FSC-Dateien generieren".