Fluoreszenzsonden-Imaging-Assay: Eine Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Darmorganoidzellen von reaktiven Sauerstoffspezies, die mit Induktoren behandelt wurden

Darmorganoide rekapitulieren die darmähnliche Krypta-Zotten-Organisation mit einem zentralen Lumen, das aus abgestorbenen Zellen und Trümmern besteht. Das Lumen ist von zottenartigen Zellen und knospenden, kryptenartigen Ausstülpungen ausgekleidet, in denen Stammzellen untergebracht sind.

Verschiedene Organoidzellen produzieren unterschiedliche Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies, ROS - Nebenprodukte von Stoffwechselaktivitäten, deren Akkumulation zu oxidativem Stress führt.

Um oxidativen Stress in verschiedenen Zellen sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit kultivierten 3D-Organoiden in einer Basalmatrix. Die organoiden Stammzellen exprimieren ein grün fluoreszierendes Protein oder ein GFP-markiertes Protein, das bei der Unterscheidung während der Bildgebung hilft.

Ergänzen Sie die Vertiefungen mit tert-Butylhydroperoxid - einem ROS-Induktor - und inkubieren Sie. Der Induktor aktiviert die membrangebundene NADPH-Oxidase und stimuliert die ROS-Produktion in den Zellen. Stammzellen, die metabolisch aktiv sind, produzieren mehr ROS als differenzierte Zellen.

Fügen Sie ROS-empfindliche fluorogene Sonden hinzu. Diese lipophilen Sonden dringen schnell in die Z