SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting

Die SUMOylierung erfolgt aufgrund der Bindung von kleinen Ubiquitin-ähnlichen Modifikatoren, SUMOs, an Substratproteine.

Die SUMOylierung tritt auf, wenn ein reifes SUMO-Peptid durch ein Enzym - E1 - aktiviert wird. Bei der Aktivierung wird das SUMO in das aktive Zentrum des konjugierenden Enzyms - E2 - übertragen und bindet das SUMO an den Lysinrest des Substratproteins. Eine weitere Ligase - E3 - erhöht die Effizienz dieser Wechselwirkung.

Um einen In-vitro-SUMOylierungsassay durchzuführen, beginnen Sie mit einem Röhrchen, das eine Mischung aus dem Substratprotein p53, Enzymen und SUMO-Peptiden enthält, und inkubieren Sie, um die SUMOylierung zu induzieren. Ergänzen Sie das Röhrchen mit Natriumdodecylsulfat - SDS-haltigem Puffer, um die Reaktion zu beenden. Erhitzen Sie die Probe, um die Proteine zu denaturieren.

Laden Sie die Proteinmischung in die Vertiefung eines SDS-PAGE-Gels und führen Sie die Elektrophorese durch. SUMOylierte Proteine mit höherem Molekulargewicht bewegen sich langsamer als ihre nicht-SUMOylierten Varianten und erzeugen zwei unterschiedliche Banden.

Das Gel wird auf eine Löschmembran übertragen, die sich auf einem nassen Filterpapier in einem Elektroblotting-Gerät befindet. Mit einem feuchten Filterpapier abdecken und die Proteine aus dem Gel auf die Membran elektroübertragen.

Behandeln Sie die Membran mit Anti-p53-Antikörpern, die an p53 binden. Overlay mit enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, die an Antikörper-p53-Komplexe binden. Fügen Sie ein chemilumineszierendes Substrat hinzu, um ein lumineszierendes Produkt zu erzeugen und die Membran abzubilden.

Eine höhere Molekulargewichtsbande entspricht SUMOylierten Proteinen, während die untere Bande nicht-SUMOylierten Proteinvarianten entspricht.

Fügen Sie 3 Mikroliter mit 100 Nanogramm pro Mikroliter gereinigten Tag-K-bZIP in die In-vitro-SUMOylierungs-Mastermix-Reaktion hinzu. Mischen Sie dann den Inhalt des Mastermixes vorsichtig und inkubieren Sie ihn 3 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter 2x SDS-PAGE mit Ladepuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Erhitzen Sie die Proben dann 5 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um das Protein zu denaturieren.

Laden Sie anschließend 20 Mikroliter der Probe auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel und lassen Sie das Gel etwa 120 Minuten lang bei 80 Volt laufen, bis der Farbstoff den Boden des Gels erreicht.

Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, trennen Sie das Gelgerät und übertragen Sie das Gel 5 Minuten lang in halbtrockenen Transferpuffer. Weichen Sie dann die PVDF-Membran in einem anderen mit Methanol gefüllten Behälter 1 Minute lang ein.

Entfernen Sie die PVDF-Membran vom Methanol und weichen Sie es in halbtrockenem Transferpuffer ein. Bewegen Sie dann die Membran 5 Minuten lang vorsichtig.

Entfernen Sie die Sicherheitsabdeckung des halbtrockenen Elektrophoresegeräts. Befeuchten Sie ein Filterpapier vor und bereiten Sie ein Gelsandwich auf der Unterseite der Platinanode vor. Nachdem Sie die Kathodenplatte in der Sicherheitsabdeckung befestigt haben, lassen Sie den Blot 90 Minuten lang mit 15 Volt Konstantstrom laufen. Schalten Sie dann die Stromversorgung aus und nehmen Sie die PVDF-Membran heraus, nachdem Sie das halbtrockene Gerät getrennt haben.

Blockieren Sie nun die PVDF-Membran mit Blockierungspuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute. Als nächstes hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-p53-Antikörpern und Blockierungspuffer für 12 bis 16 Stunden bei 4 Grad Celsius auf einem Schwebemischer bei 30 Umdrehungen pro Minute.

Nehmen Sie dann die PVDF-Membran heraus und geben Sie sie in einen Behälter, der mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 gefüllt ist. Als nächstes tränken Sie die PVDF-Membran 30 Minuten lang in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 auf dem Orbitalschüttler bei 45 Umdrehungen pro Minute. Hybridisieren Sie dann die PVDF-Membran mit Anti-Kaninchen-Antikörpern, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, verdünnt in Blockpuffer, für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schwebemischer bei 30 Umdrehungen pro Minute.

Waschen Sie anschließend die PVDF-Membran dreimal mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20. Nach dem Waschen die PVDF-Membran in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 30 Minuten lang auf dem Schwebemischer bei 45 Umdrehungen pro Minute einweichen. Ersetzen Sie dann die TRIS-gepufferte Kochsalzlösung Tween-20 durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die PVDF-Membran bis zu 12 Stunden lang bei 4 Grad Celsius zu halten.

Mischen Sie anschließend die verbesserten Chemilumineszenz-Substratreagenzien 1 und 2 im Verhältnis 1:1. Entfernen Sie dann die PVDF-Membran von der phosphatgepufferten Kochsalzlösung und tupfen Sie sie kurz mit Stanztaschen ab, um die überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen.

Geben Sie sofort 400 Mikroliter des Chemilumineszenz-Reagenzes auf die Membranoberfläche und warten Sie 3 bis 5 Minuten. Tupfen Sie es kurz ab, um das überschüssige Chemilumineszenz-Reagenz abzulassen, damit die Membran nicht vollständig austrocknet. Verwenden Sie ein Lumineszenz-Bildgebungssystem, um den Blot freizulegen.