SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting
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Biologische Techniken
0 Aufrufe • 6:00 Min. • July 8th, 2025
Die SUMOylierung erfolgt aufgrund der Bindung von kleinen Ubiquitin-ähnlichen Modifikatoren, SUMOs, an Substratproteine.
Die SUMOylierung tritt auf, wenn ein reifes SUMO-Peptid durch ein Enzym - E1 - aktiviert wird. Bei der Aktivierung wird das SUMO in das aktive Zentrum des konjugierenden Enzyms - E2 - übertragen und bindet das SUMO an den Lysinrest des Substratproteins. Eine weitere Ligase - E3 - erhöht die Effizienz dieser Wechselwirkung.
Um einen In-vitro-SUMOylierungsassay durchzuführen, beginnen Sie mit einem Röhrchen, das eine Mischung aus dem Substratprotein p53, Enzymen und SUMO-Peptiden enthält, und inkubieren Sie, um die SUMOylierung zu induzieren. Ergänzen Sie das Röhrchen mit Natriumdodecylsulfat - SDS-haltigem Puffer, um die Reaktion zu beenden. Erhitzen Sie die Probe, um die Proteine zu denaturieren.
Laden Sie die Proteinmischung in die Vertiefung eines SDS-PAGE-Gels und führen Sie die Elektrophorese durch. SUMOylierte Proteine mit höherem Molekulargewicht bewegen sich langsamer als ihre nicht-SUMOylierten Varianten und erzeugen zwei unterschiedliche Banden.
Das Gel wird auf eine Löschmembran übertragen, die sich auf einem nassen Filterpapier in einem Elektroblotting
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