Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

Zellpenetrierende Peptide, CPPs, kurze, positiv geladene Peptide, können mit zellulären Membranen interagieren und diese durchqueren, was die Abgabe von zellundurchlässigen Frachten erleichtert.

Um das Membranpermeabilisierungspotenzial eines Test-CPP in vitro unter Verwendung einer Zellmembran-Nachahmung zu untersuchen, beginnen Sie mit einer großen unilamellären Vesikelsuspension, LUV.

LUVs bestehen aus einer Phospholipid-Doppelschicht, die mit einer membranundurchlässigen Fluoreszenzsonde und einem entsprechenden Quencherpaar beladen ist. Innerhalb der Vesikel interagiert der Quencher aufgrund ihrer Nähe mit der Fluoreszenzsonde, was zu einer Fluoreszenzlöschung führt.

Pipettieren Sie die LUV-Suspension in eine Quarzfluoreszenzküvette und verdünnen Sie sie mit Puffer. Fügen Sie eine Magnetleiste hinzu. Transfer zu einem Spektrofluorometer mit magnetischem Rühren, um eine LUV-Sedimentation während des Laufs zu verhindern. Bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz, um LUV-Lecks zu vermeiden.

Geben Sie in regelmäßigen Abständen die gewünschte Konzentration an CPP in die LUV-Suspension.

Aufgrund der Hydrophobie und der Ladung der Aminosäurereste der CPPs stören sie die LUV-Lipidmembran, was zu einer Membranpenetration und Permeabilisierung führt.

Die Schädigung der Vesikelmembran führt zu einem Austritt der Fluoreszenzsonde und des Quenchers in die umgebende Lösung, wodurch sich ihre räumliche Trennung erhöht. Infolgedessen weist die Sonde eine Fluoreszenz auf.

Eine weitere Zugabe von CPP-Lösungen führt zu einer erhöhten LUV-Permeabilisierung und Fluoreszenzintensität. Eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität durch CPP-Zugabe deutet auf das membranpermeabilisierende Potenzial des Peptids hin.

Um die Fluoreszenzleckage zu messen, verdünnen Sie die LUVs in 1 Milliliter HEPES-Puffer 2 in einer Quarzfluoreszenzküvette auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar und fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Homogenisierung der Lösung während des Experiments zu erleichtern.

Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 Sekunden, um die Hintergrundfluoreszenz zu beurteilen, bevor Sie die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei Zugabe von Aliquoten der Peptidlösung in den nächsten 900 Sekunden messen.

Um eine Fluoreszenzleckage von 100 % als Positivkontrolle zu messen, fügen Sie den LUVs 1 Mikroliter Triton X-100 hinzu, um die Vesikel aufzulösen, was zu einer vollständigen Entlöschung der Sonde in den letzten 100 Sekunden der Analyse führt. Verwenden Sie dann die Formel, um den Prozentsatz der Leckage zu jedem Zeitpunkt zu berechnen.