Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

Zellpenetrierende Peptide, CPPs, kurze, positiv geladene Peptide, können mit zellulären Membranen interagieren und diese durchqueren, was die Abgabe von zellundurchlässigen Frachten erleichtert.

Um das Membranpermeabilisierungspotenzial eines Test-CPP in vitro unter Verwendung einer Zellmembran-Nachahmung zu untersuchen, beginnen Sie mit einer großen unilamellären Vesikelsuspension, LUV.

LUVs bestehen aus einer Phospholipid-Doppelschicht, die mit einer membranundurchlässigen Fluoreszenzsonde und einem entsprechenden Quencherpaar beladen ist. Innerhalb der Vesikel interagiert der Quencher aufgrund ihrer Nähe mit der Fluoreszenzsonde, was zu einer Fluoreszenzlöschung führt.

Pipettieren Sie die LUV-Suspension in eine Quarzfluoreszenzküvette und verdünnen Sie sie mit Puffer. Fügen Sie eine Magnetleiste hinzu. Transfer zu einem Spektrofluorometer mit magnetischem Rühren, um eine LUV-Sedimentation während des Laufs zu verhindern. Bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz, um LUV-Lecks zu vermeiden.

Geben Sie in regelmäßigen Abständen die gewünschte Konzentration an CPP in die LUV-Suspension.

Aufgrund der Hydrophobie und der Ladung der Aminosäurereste der CPPs stören sie die LUV-Lipidmembr