JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 5:00 Min. • July 8th, 2025
Monoamin-Neurotransmitter, endogene chemische Botenstoffe, leiten Signale über die Synapse, den Kontaktpunkt zwischen den Neuronen, weiter. Ein streng reguliertes Monoamin-Neurotransmittersystem ist für die normale neuronale Funktion unerlässlich.
Um die Wirkung eines Prüfarzneimittels auf die Monoaminfreisetzung ex vivo zu screenen, erhalten Sie Gewebeschnitte des Rattenhirns, die den interessierenden Bereich in einem gekühlten sauerstoffhaltigen Puffer enthalten, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
Die Gewebeschnitte werden in Vertiefungen einer Multi-Well-Platte mit porösen Filtereinsätzen übertragen, die mit einer gasförmigen Gemischversorgung verbunden sind und sauerstoffhaltige künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) enthalten, die mit Monoaminoxidase-Hemmern ergänzt wird. Ausbrüten.
Die Inhibitoren diffundieren in die Zellen und inaktivieren Monoaminoxidase-Enzyme, wodurch der Abbau von Monoaminen verhindert und ihre Konzentration erhöht wird, die für die Lagerung und Freisetzung zur Verfügung steht.
Die gewebehaltigen Inserts werden in Vertiefungen mit sauerstoffhaltigem aCSF und dem Testarzneimittel überführt. Ausbrüten. Das Medikament kann das Monoamin-Neurotransmittersystem stimulieren, indem es die Monoaminkonzentration im extraneuronalen Raum erhöht, was zu ihrer Freisetzung aus dem Gehirngewebe in Lösung führt.
Die freigesetzten Monoamine gelangen durch die porösen Einlagen in die Vertiefungen und trennen sich vom Gewebe.
Entfernen Sie nach der Inkubation die Gewebescheiben-haltigen Einsätze. Die Monoaminlösung wird in einem Röhrchen gesammelt, das ein Lösungsmittel enthält, das mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kompatibel ist. Füllen Sie den Rohrinhalt in vormontierte Filtereinheiten um. Zentrifuge, die die wichtigsten Verunreinigungen entfernt.
Laden Sie das erhaltene Filtrat in die HPLC-Säule und führen Sie einen Chromatographielauf durch, um die Monoaminkonzentration zu bestimmen, die auf die Wirkung des Testarzneimittels auf die Monoaminfreisetzung hinweist.
Um die Monoaminfreisetzung zu induzieren, übertragen Sie die Gewebeproben in jede Vertiefung einer speziell angefertigten 48-Well-Effluxkammer, die 0,5 bis 1 Milliliter Effluxpuffer pro Vertiefung mit konstanter, sanfter Blasenbildung enthält, und lassen Sie die Proben 30 bis 50 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erholen.
Am Ende der Gleichgewichtsphase wird der Gewebehalter mit dem Hirngewebe in Vertiefungen mit 500 Mikrolitern sauerstoffreichem Effluxpuffer mit oder ohne pharmakologisches Mittel verschoben, wobei der Halter am Rand der Vertiefung angeklopft wird, um einen minimalen Transfer des Puffers zwischen den Vertiefungen zu verhindern, für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Bringen Sie den Halter am Ende der Inkubation in einen neuen Satz Vertiefungen mit 500 Mikrolitern Effluxpuffer mit oder ohne das betreffende Arzneimittel und stellen Sie die Platte für weitere 20 Minuten in den Zellkultur-Inkubator zurück.
Während der zweiten Inkubation wird die Lösung aus den Vertiefungen der ersten Inkubation in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 1 N Perchlor- oder Phosphorsäure auf Eis überführt und die Röhrchen mit #1 beschriftet.
Am Ende der zweiten Inkubation wird der Gewebehalter in leere Vertiefungen mit der Platte auf Eis gebracht und die Überstände aus der zweiten Inkubation in neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 1 N Perchlor- oder Phosphorsäure auf Eis übertragen. Beschriften Sie diese Tuben mit #2.
Wenn alle Überstände übertragen wurden, geben Sie 1 Milliliter eiskalten Dissektionspuffer in jede Vertiefung des Gewebes und übertragen Sie jede Gewebeprobe mit einer kleinen Pinzette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie den Puffer aus den Probenröhrchen und lagern Sie das Gewebe bei -80 Grad Celsius. Übertragen Sie dann die gesammelten Inkubationslösungen zur Zentrifugation in Mikrozentrifugen-Filterröhrchen und legen Sie das Filtrat bis zur HPLC-Analyse auf Eis.