PolyQ Aggregation Assay zur Identifizierung der neuroprotektiven Wirkung einer Substanz in Würmern

Bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen besteht das krankheitsassoziierte Protein aus einem expandierten Polyglutamin-Trakt, polyQ, – einer Kette aufeinanderfolgender Glutaminreste – und ist aberrant konform. Die gestörte Konformation destabilisiert die Proteinhomöostase, was zu einer Proteinakkumulation und Bildung toxischer Aggregate führt, was zu neuronaler Dysfunktion und Tod führt.

Um die Schutzfähigkeit einer Testsubstanz bei der Linderung der PolyQ-Aggregations-assoziierten Proteotoxizität zu untersuchen, wird eine Suspension von transgenen Caenorhabditis elegans-Larven erhalten, die fluoreszenzmarkierte polyQ-Proteine in Körperwandmuskelzellen exprimieren.

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Medien, die mit bakterieller Nahrung ergänzt sind. Geben Sie die Testverbindung in eine Vertiefung. Übertragen Sie die Larven in die Multi-Well-Platte. Versiegeln Sie die Platte, um eine Austrocknung des Mediums und eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Inkubieren Sie, damit die Larven zu erwachsenen Larven heranwachsen können.

Während der Entwicklung, wenn der Fadenwurm altert, sammeln sich polyQ-Proteine nach und nach in den Muskelzellen an und bilden Aggregate.

Liegt die Testsubstanz in Medien vor, gelangt sie in die Muskelzellen und kann je nach ihrer Schutzkapazität eine Anti-PolyQ-Aggregationswirkung ausüben, die die PolyQ-Aggregation unterdrückt und verzögert

Ernte die adulten Nematoden und zentrifugiere sie. Suspendieren Sie die pelletierten Nematoden. In eine Multi-Well-Platte umfüllen. Immobilisieren Sie die Nematoden mit Natriumazid.

Zählen Sie mit einem hochauflösenden Fluoreszenzgerät die fluoreszierenden Puncta, die polyQ-Aggregate darstellen, pro Fadenwurm.

Eine geringere durchschnittliche Anzahl von PolyQ-Aggregaten in der Behandlung als in Kontrollvertiefungen deutet auf eine höhere Schutzkapazität der Testsubstanz bei der Linderung der PolyQ-Aggregations-assoziierten Proteotoxizität hin.

Beginnen Sie mit der Übertragung von 300 bis 500 synchronisierten L1-Larven von AM141-Nematoden in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 Mikrolitern S-Medium, das den OP50-Stamm von E. coli enthält, und fünf Milligramm pro Milliliter Astragalan. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie bei 20 Grad Celsius und 120 Umdrehungen pro Minute für die gewünschten Zeitintervalle.

Übertragen Sie die Nematoden in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie dreimal durch Zentrifugation mit M9-Puffer, um die restlichen OP50-Zellen zu entfernen. Suspendieren Sie dann die AM141-Nematoden im M9-Puffer.

Übertragen Sie nun 10 bis 15 Nematoden in jede Vertiefung in einer 384-Well-Platte, setzen Sie 10 Replizierungswells für jede Behandlung und fügen Sie 10 Mikroliter 200 millimolare Natriumazide in jede Vertiefung hinzu, um die Nematoden zu lähmen, indem Sie ihnen ermöglichen, sich auf dem Boden abzusetzen.

Platzieren Sie die Platte in einem High-Content-Bildgebungssystem, um Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und richten Sie die im Textmanuskript genannten Parameter ein. Analysieren Sie die Bilddaten, indem Sie das Fenster "Plattendaten überprüfen" öffnen und die "Testplatte" für die Bildanalyse auswählen.

Doppelklicken Sie auf eine Testvertiefung, um ihr Bild anzuzeigen. Wählen Sie dann "Count Nuclei" als Analysemethode aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Einstellungen konfigurieren". Definieren Sie das Quellbild aus dem FITC-Kanal und wählen Sie den "Standardalgorithmus".

Stellen Sie die Bildanalyseparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und testen Sie sie, um die Analysemethode zu optimieren. Speichern Sie die Einstellungen, und führen Sie die Analyse für alle Vertiefungen aus. Exportieren Sie die "Gesamtkerne" als Gesamtzahl der Q40::YFP-Aggregate in jedem Well.

Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in jeder Vertiefung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Q40::YFP-Aggregaten pro Nematode in jeder Gruppe. Berechnen Sie dann den Inhibitionsindex.