Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

In lebenden Zellen wandelt das Enzym Laktatdehydrogenase unter anaeroben Bedingungen Pyruvat – ein Endprodukt der Glykolyse – in Laktat um – einen Schlüsselmetaboliten. Die Menge an Laktat, die in den Zellen produziert wird, spiegelt ihren Stoffwechselstatus wider.

Um die intrazelluläre Laktatkonzentration zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer Testprobe aus proteinfreiem Nematodenzelllysat. Ergänzen Sie andere Vertiefungen einer Multi-Well-Platte mit einer Laktatlösung in verschiedenen bekannten Konzentrationen.

Dem Lysat fehlen alle proteinhaltigen Enzyme, einschließlich der endogenen Laktatdehydrogenase, was eine genaue Laktatquantifizierung gewährleistet.

Geben Sie einen Laktat-Assay-Puffer in jede Vertiefung, um den entsprechenden pH-Wert für eine optimale enzymatische Aktivität aufrechtzuerhalten. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit einem Reaktionsgemisch, das das Enzym Laktatdehydrogenase, das Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), ein Coenzym und eine kolorimetrische Sonde enthält, und inkubieren Sie.

Während der Inkubation katalysiert die Laktatdehydrogenase die Oxidation von zellulärem Laktat zu Pyruvat bei gleichzeitiger Reduktion von NAD zu NADH. Das erzeugte NADH reagi