Warum ist die Abhängigkeit von Lactatdehydrogenase für die Zielvalidierung wichtig?

Der Assay beruht auf einer exogenen Lactatdehydrogenase, die Lactat in Pyruvat umwandelt, wodurch sichergestellt wird, dass die Signalgenerierung nicht durch endogene Enzyme im Lysat beeinträchtigt wird. Diese Abhängigkeit ermöglicht eine spezifische Zuordnung des kolorimetrischen Signals zur Lactatkonzentration und unterstützt so eine genaue Validierung des Zielmoleküls in Stoffwechselwegen.

Wie passt die Isolierung von Lactat als unabhängige Variable in die Entdeckungspipeline?

Durch die Quantifizierung der Lactatspiegel in Abhängigkeit von experimentellen Bedingungen isoliert der Assay Lactat als messbare Größe des glykolytischen Flusses und ermöglicht es Forschern, genetische oder pharmakologische Störungen mit Veränderungen des Energiestoffwechsels zu verknüpfen. Dies unterstützt die frühe Entdeckung, indem ein entrisikierter, quantitativer Biomarker für die Aktivität eines Signalwegs bereitgestellt wird.

Wozu ermöglichen quantitative Absorptionsmessungen bei 570 nm?

Absorptionsmessungen bei 570 nm, nach Hintergrundsubtraktion, werden verwendet, um eine Standardkurve aus bekannten Lactatkonzentrationen zu erstellen, wodurch die Interpolation von Lactatspiegeln in Testproben ermöglicht wird. Diese quantitative Ausgabe erlaubt die Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen und den Vergleich zwischen experimentellen Gruppen in Screening-Kampagnen.

Warum sind Anforderungen an die Duplikatanalyse für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg wichtig?

Die Durchführung von Duplikatmessungen für jede Probe erhöht die Datenzuverlässigkeit und verringert die technische Varianz, was für eine konsistente Interpretation zwischen Biologie-, Screening- und Analytikteams unerlässlich ist. Diese Praxis unterstützt reproduzierbare Übergaben zwischen Entdeckungs- und präklinischen Einheiten.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind vor der Implementierung erforderlich?

Die Teams müssen in der Lage sein, eine Kalibrierkurve zu erstellen, eine lineare Regression durchzuführen und unbekannte Konzentrationen aus der Kurve zu interpolieren, gefolgt von einer Korrektur des Verdünnungsfaktors (z. B. Multiplikation mit 2,25, wie im Protokoll angegeben). Diese Fähigkeiten gewährleisten eine genaue Lactatquantifizierung anhand der rohen Absorptionsdaten.

Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Techniken

0 Ansichten • 3:08 Min. • July 8th, 2025

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In lebenden Zellen wandelt das Enzym Laktatdehydrogenase unter anaeroben Bedingungen Pyruvat – ein Endprodukt der Glykolyse – in Laktat um – einen Schlüsselmetaboliten. Die Menge an Laktat, die in den Zellen produziert wird, spiegelt ihren Stoffwechselstatus wider.

Um die intrazelluläre Laktatkonzentration zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer Testprobe aus proteinfreiem Nematodenzelllysat. Ergänzen Sie andere Vertiefungen einer Multi-Well-Platte mit einer Laktatlösung in verschiedenen bekannten Konzentrationen.

Dem Lysat fehlen alle proteinhaltigen Enzyme, einschließlich der endogenen Laktatdehydrogenase, was eine genaue Laktatquantifizierung gewährleistet.

Geben Sie einen Laktat-Assay-Puffer in jede Vertiefung, um den entsprechenden pH-Wert für eine optimale enzymatische Aktivität aufrechtzuerhalten. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit einem Reaktionsgemisch, das das Enzym Laktatdehydrogenase, das Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), ein Coenzym und eine kolorimetrische Sonde enthält, und inkubieren Sie.

Während der Inkubation katalysiert die Laktatdehydrogenase die Oxidation von zellulärem Laktat zu Pyruvat bei gleichzeitiger Reduktion von NAD zu NADH. Das erzeugte NADH reagiert mit der kolorimetrischen Sonde zu einem violetten Produkt.

Messen Sie spektroskopisch die Extinktion der violetten Lösung für die Testprobe und die Laktatstandards bei 570 Nanometern. Tragen Sie die Absorptionswerte der Laktatstandards auf und erstellen Sie die Kalibrierkurve.

Vergleichen Sie abschließend den Absorptionswert der Probe mit den Laktatstandards, um die in der Testprobe vorhandene Laktatmenge zu bestimmen.

Um die Laktatkonzentration zu messen, verwenden Sie ein kolorimetrisches Assay-Kit, um eine Duplikatanalyse für die Testproben durchzuführen. Geben Sie 10 Mikroliter der Testproben in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und fügen Sie dann jeder Probe Laktat-Assay-Puffer hinzu, um das Volumen auf 50 Mikroliter einzustellen.

Verdünnen Sie 100 Millimolare L(+)-Laktat-Standards mit einem Laktat-Assay-Puffer auf 1 Millimolar. Geben Sie dann 0, 2, 4, 6, 8 und 10 Mikroliter verdünnten L(+)-Lactatstandard in eine Reihe von Vertiefungen. Geben Sie 50 Mikroliter Reaktionsmischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt, damit sich die Farbe entwickeln kann.

Verwenden Sie schließlich ein Mikroplatten-Reader, um die Absorption jeder Vertiefung bei 570 Nanometern zu messen. Subtrahieren Sie die Absorption des Hintergrundkontrollgemisches von der Absorption des Reaktionsgemisches. Zeichnen Sie dann die Laktat-Standardkurve und berechnen Sie die Laktatkonzentrationen aus der Kurve, indem Sie jede Konzentration mit 2,25 multiplizieren.