Östrogenrezeptor-Reporter-Aktivitätsassay zum Screening der östrogenen Aktivität von Phytoöstrogen

Östrogene sind Steroidhormone, die als endokrine Signalmoleküle wirken und an nukleäre Rezeptoren binden – Östrogenrezeptoren beta – und Östrogen-beta-Rezeptorkomplexe bilden.

Diese Liganden-Rezeptor-Komplexe dimerisieren und bilden Homodimere im Zytoplasma der Zelle. Das resultierende Homodimer gelangt in den Zellkern, bindet an das Östrogen-Reaktionselement ERE – eine spezifische DNA-Sequenz innerhalb des Promotors des Zielgens – und leitet die Transkription ein.

Um die östrogene Aktivität von Phytoöstrogenen – pflanzlichen Sekundärmetaboliten, die die Östrogenfunktion nachahmen – zu bestimmen, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die Reporterzellen enthält, die in einem geeigneten Medium suspendiert sind.

Die Reporterzellen werden so verändert, dass sie die Östrogenrezeptoren beta überexprimieren und mit einem Luciferase-Gen transfiziert, das mit dem ERE-Promotor fusioniert ist. Die Probenlösung, die Phytoöstrogene enthält, zugeben und inkubieren.

Während der Inkubation bindet das Phytoöstrogen an die Östrogenrezeptoren, Beta – exprimiert in den Reporterzellen. Sobald sie gebunden sind, dimerisieren sich die Phytoöstrogen-Rezeptor-Komplexe und translozieren in den Zellkern.

Im Zellkern bindet der dimerisierte Komplex an das ERE. Die Bindung initiiert die Transkription des Luciferase-Gens, wodurch das Luciferase-Enzym entsteht. Entfernen Sie dann das Medium und fügen Sie ein Reagenz hinzu, das ein Substrat für Luciferase enthält. Inkubieren, damit das exprimierte Luciferase-Enzym sein Substrat oxidieren und Lumineszenz erzeugen kann.

Messen Sie die Lumineszenz, die die östrogene Aktivität der Verbindung in der Probe bestätigt.

Wirbeln Sie die Proben. Geben Sie dann 4 Mikroliter jeder Probe in 496 Mikroliter Siebmedium für Verbindungen, um eine 0,8%ige DMSO-Lösung zu erhalten.

Desinfizieren Sie die Außenfläche eines vorgewärmten Zellwiederherstellungsmediums mit 70 % Ethanol und geben Sie 10 Milliliter des Mediums in ein Röhrchen mit gefrorenen Reporterzellen, um sie aufzutauen. Schließen Sie das Röhrchen mit den Reporterzellen und legen Sie es für 5 bis 10 Minuten in ein 37 Grad heißes Wasserbad.

Nachdem Sie die Zellen aus dem Wasserbad entnommen haben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um Zellaggregate aufzubrechen und eine homogene Suspension herzustellen. Reinigen Sie dann die Oberfläche der Tube mit 70% Ethanol.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter der Reporterzellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu dosieren. Geben Sie dann 100 Mikroliter Proben in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 22 bis 24 Stunden.

Nehmen Sie kurz vor dem Ende der Platteninkubation das Detektionssubstrat und den Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie an einen lichtschwachen Ort, bis sie auf Raumtemperatur ausgeglichen sind. Drehen Sie dann jedes Röhrchen vorsichtig um, um die Lösungen zu mischen.

Unmittelbar bevor die Platteninkubation abgeschlossen ist, gießen Sie den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Röhrchen mit dem Detektionssubstrat, um ein Luciferase-Detektionsreagenz herzustellen. Mischen Sie die Tube vorsichtig, um keinen Schaum zu erzeugen.

Entsorgen Sie den Inhalt der Probenplatte in einen geeigneten Abfallbehälter und klopfen Sie ihn vorsichtig auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Vertiefungen zu entfernen. Geben Sie 100 Mikroliter des Luciferase-Nachweisreagenzes in jede Vertiefung und lassen Sie die Assay-Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Quantifizieren Sie dann die Lumineszenz mit einem 96-Well-Platten-Lunometer.