Lumineszenz-basierter Assay zur Beurteilung der Neurotoxizität von Testverbindungen auf Neuronen

Das

Auswachsen von Neuriten – wo Neuronen Projektionen entwickeln – ist entscheidend für die neuronale Funktion und Regeneration.

Um die neurotoxischen Wirkungen von Neuritenauswuchs-fördernden Testverbindungen in vitro zu bewerten, wird eine humane neurale Vorläuferzelle, hNPC, in Differenzierungsmedien suspendiert.

Säen Sie die Zellen in Multi-Well-Plattenvertiefungen aus, die mit Poly-L-Lysin und Laminin beschichtet sind, um die Zellanhaftung am Well-Boden zu erleichtern und das Zellwachstum zu unterstützen. Die Bestandteile der Differenzierungsmedien fördern die hNPC-Differenzierung in Neuronen.

Behandeln Sie einen Satz Vertiefungen mit einer Testverbindung, die das Wachstum von Neuriten fördert. Dies interagiert mit den von hNPC abgeleiteten Neuronen und kann das Wachstum von Neuriten induzieren, ohne die zellulären Stoffwechselprozesse und die anschließende Konzentration von Adenosintriphosphat, ATP – der primären zellulären Energiequelle – zu stören.

Fügen Sie das einstufige Reagenz hinzu, das Detergenzien, das Luciferase-Enzym und das Luciferase-Substrat, Luciferin und ATPase-Hemmer zusammen mit Magnesiumionen enthält, und mischen Sie.

Detergenzien stören die Zellmembran, was zu einer Zelllyse und einer intrazellulären ATP-Freisetzung in die Lösung führt. ATPase-Inhibitoren hemmen die freigesetzte endogene ATPase, was die ATP-Messung beeinträchtigen kann. Zentrifuge, Sedimentation von Zelltrümmern.

Während der Inkubation bewirkt das freigesetzte ATP mit Magnesiumionen, dass Luciferin an Luciferase bindet, was zu einer Luciferin-Oxidation zu hochangeregtem Oxyluciferin führt, das bei Entspannung in seinen Grundzustand ein biolumineszierendes Photon emittiert. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Lumineszenz, die auf die ATP-Konzentration hinweist.

Eine höhere ATP-Konzentration stellt eine höhere Zellviabilität dar, was darauf hindeutet, dass es keine signifikante Toxizität der Testsubstanz für Neuronen gibt.

Um die Platte zu beschichten, geben Sie 30 Mikroliter Poly-L-Lysin in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie es zweimal mit PBS und lassen Sie es ca. 30 Minuten trocknen.

Geben Sie 30 Mikroliter Laminin in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte dann 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Waschgänge mit PBS und fahren Sie mit dem Plattieren der Zellen fort. Geben Sie 20.000 einzellige Neurosphären in 25 Mikrolitern Differenzierungsmedium in jede Vertiefung der 384-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte 5 Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Hochpräzise Pipettierfähigkeiten sind erforderlich, um die genaue Anzahl der Neurosphären zu plattieren, die in einzelne Zellen zerlegt werden. Daher wird empfohlen, die Neurosphären vor dem Plattieren in Neuronen zu differenzieren, um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen.

Geben Sie nach der Inkubation 5 Mikroliter Testverbindung in jede Vertiefung in der 6-fachen der gewünschten Konzentration und inkubieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden lang.

Um den Zellviabilitätsassay durchzuführen, geben Sie 30 Mikroliter Lumineszenzreagenz in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte 2 Minuten lang auf einem Shaker. Zentrifugieren Sie die Platte 30 Sekunden lang bei 300 bis 400 g g. Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht. Messen Sie nach der Inkubation die Lumineszenz auf einem Mikroplatten-Reader.