Gradientenpolymerase-Kettenreaktion zur Bestimmung der optimalen Glühtemperatur
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:30 Min. • July 8th, 2025
Die Gradientenpolymerase-Kettenreaktion ist eine Technik zur Optimierung der Annealing-Temperatur, bei der Primer – sequenzspezifische, einzelsträngige DNA – an die komplementären Stellen auf der Matrizen-DNA binden.
Nehmen Sie eine Mischung aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern, dNTPs und thermostabiler DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer ein. Fügen Sie die Template-DNA hinzu und überführen Sie die Bestandteile in eine PCR-Platte.
Legen Sie die Platte in einen Gradienten-Thermocycler mit einem speziellen Heizblock. Dadurch wird ein linearer Gradient der Glühtemperatur zwischen 55 °C und 65 °C mit einem gleichmäßigen Temperaturanstieg in der gesamten Platte hergestellt.
Bei der Reaktion wird die Platte auf eine hohe Temperatur erhitzt, wodurch die doppelsträngige DNA in Einzelstränge denaturiert und die DNA-Polymerase aktiviert wird. Später wird die Temperatur entsprechend den programmierten Werten in jeder Vertiefung gesenkt, was das Glühen der Grundierung erleichtert.
Bei einer unteroptimalen Glühtemperatur binden die Primer unspezifisch an die denaturierte DNA, was zu einer unspezifischen Amplifikation während der PCR-Reaktion führt. Bei überoptimaler Temperatur binden zu ger
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