Quantitativer Dot-Blot zur Schätzung von Zielproteinen in einem Gewebelysat

Der quantitative Dot-Blot – oder QDB – ist eine nützliche Technik, um die Konzentration von Zielproteinen in einer Probe zu quantifizieren. Sobald die Probe auf einer Polymermembran immobilisiert ist, können die Proteine durch Immunblotting nachgewiesen werden.

Nehmen Sie zunächst eine QDB-Platte – eine Multi-Well-Platte mit einer Nitrozellulosemembran, die am Boden jeder Vertiefung befestigt ist. Fügen Sie die Probe – ein Gewebelysat, das das Zielprotein enthält – in der Mitte der Membran in der Vertiefung hinzu.

Lassen Sie die Probe trocknen. Das Zielprotein bindet über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Membran.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu. Die Proteine in der Lösung binden sich an die ungebundenen Stellen auf der Membran und verhindern so die unspezifische Bindung von Nachweisreagenzien.

Fügen Sie als Nächstes eine Lösung hinzu, die Primärantikörper enthält, die an das Zielprotein in der Probe binden. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie dann eine sekundäre Antikörperlösung hinzu. Diese Moleküle – markiert mit einem Peroxidase-Enzym – binden an die proteingebundenen Primärantikörper. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie schließlich eine Lösung hinzu, die ein chemilumineszierendes Substrat und Wasserstoffperoxid enthält. Unter Verwendung von Wasserstoffperoxid oxidiert die Antikörper-gebundene Peroxidase das Substrat und gibt Licht ab. Messen Sie mit einem Plattenlesegerät die Lumineszenzintensität der Probe.

Erzeugen Sie eine Standard-Lumineszenzkurve unter Verwendung einer seriellen Verdünnung mit bekannten Konzentrationen des Zielproteins. Tragen Sie den gemessenen Lumineszenzwert der Probe auf der Kurve auf, um die Zielproteinkonzentration zu bestimmen.

Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine leere Pipettenspitzenbox unter der QDB-Platte, um zu vermeiden, dass die Unterseite der Platte die Tischoberfläche berührt. Laden Sie bis zu 2 Mikroliter der Probe in die Membranmitte am Boden einer einzelnen Einheit der QDB-Platte.

Lassen Sie die Unterseite der QDB-Platte während des Ladens niemals eine Oberfläche berühren und laden Sie nicht zu viel für einzelne Vertiefungen. Sie haben Erfahrung nicht mehr als 4 Mikroliter pro Well.

Lassen Sie anschließend die geladene QDB-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder lassen Sie die geladene Platte fünfzehn Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem gut belüfteten Raum. Um die Platte zu blockieren, tauchen Sie die QDB-Platte in den Transferpuffer und schütteln Sie sie vorsichtig 10 Sekunden lang.

Spülen Sie danach die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann fünf Minuten lang in TBST unter ständigem Schütteln. Blockieren Sie anschließend die QDB-Platte mit Blockierpuffer für eine Stunde unter ständigem Schütteln. Verdünnen Sie nun den Primärantikörper im Blockierungspuffer in einer gewählten Konzentration und geben Sie 100 Mikroliter davon in jede einzelne Vertiefung einer gewöhnlichen 96-Well-Platte.

Setzen Sie die QDB-Platte in die 96-Well-Platte ein und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die Platte danach dreimal vorsichtig mit TBST ab, bevor Sie sie dreimal mit TBST waschen - jedes Mal fünf Minuten lang unter ständigem Schütteln.

Als nächstes verdünnen Sie den Sekundärantikörper in dem Blockierungspuffer in der gewählten Konzentration und aliquotieren Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie dann die QDB-Platte in der beladenen 96-Well-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann dreimal à fünf Minuten mit TBST unter ständigem Schütteln.

Für die Quantifizierung bereiten Sie das ECL-Substrat vor und aliquotieren Sie es in eine 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern pro Well. Setzen Sie dann die QDB-Platte zwei Minuten lang unter ständigem Schütteln in die 96-Well-Platte ein. Nehmen Sie danach die QDB-Platte von der 96-Well-Platte und schütteln Sie sie kurz, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie anschließend die Platte auf eine weiße Mikrotiterplatte. Schalten Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader ein und wählen Sie auf der Benutzeroberfläche die Platte mit Abdeckung aus, bevor Sie die kombinierten Platten zur Quantifizierung in den Mikroplatten-Reader legen.