Quantitatives Western Blot zur Abschätzung der Proteinexpressionsniveaus

Quantitatives Western Blotting – eine auf der Normalisierung von Gesamtproteinen basierende Technik – ist nützlich für die Quantifizierung der Expression von Zielproteinen.

Laden Sie zunächst Gewebelysat in die Vertiefungen eines Polyacrylamid-Gradientengels. Das Lysat enthält das Zielprotein zusammen mit anderen zellulären Proteinen.

Lassen Sie das Gel mit einer geeigneten Spannung für die elektrophoretische Trennung der Probenproteine entlang des Gradienten laufen. Legen Sie das Gel nach Abschluss auf die Polymermembran eines Transferstapels.

Anlegen eines elektrischen Stroms, um die abgetrennten Proteine auf die Membran zu übertragen. Legen Sie als Nächstes die Membran in eine fluoreszierende Gesamtproteinfärbung. Die geladenen Farbstoffmoleküle in der Färbung binden elektrostatisch an alle Proteine auf der Membran.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu. Die Proteine in der Lösung binden also an die Membran. Verhinderung der unspezifischen Bindung von Nachweisreagenzien. Fügen Sie einen primären Antikörper hinzu, der nur an das Zielprotein bindet. Fügen Sie dann einen Sekundärantikörper hinzu, der mit einem Fluorophor markiert ist und an den Primärantikörper bindet.

Stimulieren Sie die Probe mit einem Laser. Erfassen Sie die emittierte Fluoreszenz von den Farbstoffmolekülen der Gesamtproteinfärbung und den antikörpergebundenen Fluorophoren bei den entsprechenden Wellenlängen.

Um den normalisierten Proteinbeladungswert zu berechnen, dividieren Sie das Gesamtproteinsignal jeder Spur durch den höchsten Wert. Dividieren Sie das Zielproteinsignal durch den entsprechenden normierten Ladungswert, um die relative Expression des Zielproteins zu bestimmen.

Für die Elektrophorese setzen Sie ein vorgegossenes 4 bis 12 % Bis-Tris-Gradientengel in das Gelelektrophorese-Kammersystem und laden Sie 3,5 Mikroliter eines Proteinstandards in die Vertiefung. Wenn Sie einen internen Standard für die Normalisierung zwischen den Membranen verwenden, laden Sie eine Menge, die den anderen Proben entspricht, in die ersten drei Vertiefungen neben der Proteinleiter und laden Sie 30 Mikrogramm jeder Probe in die verbleibenden Vertiefungen. Lassen Sie die Proben dann 10 Minuten lang bei 80 Volt und anschließend weitere 45 bis 60 Minuten bei 150 Volt durch das Stapelgel laufen.

Am Ende der Elektrophorese wird zum Zusammenbau des Transferstapels das Proteingel auf den unteren Stapel gelegt, der die Polyvinylidendifluoridmembran enthält, gefolgt vom Filterpapier. Verwenden Sie die Löschwalze, um alle Luftblasen zu entfernen, und legen Sie den oberen Stapel auf das Filterpapier, bevor Sie den Stapel erneut rollen, um Luftblasen zu entfernen.

Übertragen Sie den gesamten Stapel mit der Elektrode auf der linken Seite des Geräts in die Transfervorrichtung und legen Sie den Gelschwamm auf den Stapel, so dass der Schwamm mit den entsprechenden elektrischen Kontakten am Gerät ausgerichtet ist.

Wählen Sie nach dem Schließen des Deckels das entsprechende Programm aus und starten Sie es. Schneiden Sie die Membran am Ende des Programms auf die Gelgröße und waschen Sie die geschnittene Membran schnell mit doppelt destilliertem Wasser, bevor Sie mit der Gesamtproteinfärbung fortfahren.

Für die Totalproteinfärbung rollen Sie die Membran mit der Proteinseite nach innen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und markieren Sie die Membran mit 5 Millilitern Proteinfärbelösung auf einer Walze für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Abzug.

Waschen Sie die Membran am Ende der Inkubation schnell mit 5 Millilitern Waschlösung, legen Sie den Schlauch zwischen den Wäschen kurz wieder auf die Walze und spülen Sie ihn anschließend kurz mit Reinstwasser ab. Geben Sie 3 Millimeter Blockierungspuffer auf die Membran und legen Sie die Membran für 30 Minuten bei Raumtemperatur wieder auf die Walze. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer durch den primären Antikörper von Interesse in der entsprechenden optimierten Konzentration und inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 Grad Celsius auf der Walze.

Waschen Sie die Membran am nächsten Tag 6 Mal für 5 Minuten mit 5 Millilitern frischem PBS pro Waschgang auf der Walze bei Raumtemperatur. Nach dem letzten Waschen inkubieren Sie die Membran mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung auf der Walze für 1 Stunde bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 Waschgängen für 30 Minuten pro Waschgang. Trocknen Sie die Membran nach dem letzten Waschen und verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Membran vor Licht zu schützen.

Für die Bildaufnahme legen Sie die Membran mit der Proteinseite nach unten auf den Scanner und wählen Sie den Scanbereich in der Software aus. Erfassen Sie dann Bilder in beiden Kanälen und exportieren Sie die Bilder in ein entsprechendes Bildanalyseprogramm.

Zeigen Sie den 700-Nanometer-Kanal an, um das Gesamtergebnis der Proteinfärbung anzuzeigen, wählen Sie "Analyse" und zeichnen Sie ein Rechteck, um den für die Normalisierung relevanten Bereich zu definieren. Kopieren Sie dann den ersten Rechteckbereich und fügen Sie ihn in jede einzelne Probe ein, um sicherzustellen, dass der definierte Bereich für alle analysierten Spuren die gleiche Größe hat.

Um die Proteinkonzentration in jeder Spur zu quantifizieren, kopieren Sie die Ergebnisse sowohl der Gesamtproteinfärbung als auch des interessierenden Proteins in ein Tabellenkalkulationsprogramm und bestimmen Sie das höchste Gesamtproteinfärbesignal. Teilen Sie dann jeden Signalwert der Gesamtproteinfärbung durch diesen Wert, um den normalisierten Proteinladewert zu erhalten, und dividieren Sie den 800-Nanometer-Signalwert von jeder einzelnen Probe durch den entsprechenden normalisierten Proteinwert, um das relative Proteinexpressionsverhältnis in verschiedenen Proben zu berechnen.