Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

CD95 – ein Todesrezeptor – bindet an seine agonistischen Antikörper und löst den Aufbau eines todbringenden Signalkomplexes (DISC) aus – einem Multiproteinkomplex, der Procasase 8 rekrutiert. An der DISC dimerisiert die Procaspase 8 und verarbeitet sich zu verschiedenen Zwischenspaltprodukten und schließlich zu einer aktiven Form, die die Apoptose einleitet.

Zur Analyse der Caspase-Acht-Verarbeitung mittels chemilumineszierendem Western Blot wird ein Lysat in einem Röhrchen entnommen, das DISC-assoziierte Zwischenspaltungsprodukte von Caspase 8 enthält. Ergänzen Sie dies mit Protein-A-Agarose-Beads-eingefangenen Anti-CD95-Antikörpern. Die Anti-CD95-Antikörper binden an die DISC-Komponente CD95 und bilden Proteinkomplexe.

Laden Sie die Probe auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel, um die unterschiedlich großen immunpräzipitierten Caspase-8-Zwischenprodukte als unterschiedliche Banden zu trennen. Legen Sie das Gel auf eine Löschfolie und legen Sie elektrischen Strom an. Die Caspase-8-Zwischenprodukte bewegen sich aus dem Gel auf die Blotting-Membran.

Behandeln Sie die Membran mit einer blockierenden proteinhaltigen Lösung, um die Proteinbindungsstellen zu sättigen und so unspezifische Bindung