Southern-Blot zum Nachweis homologer Rekombination im Genom embryonaler Stammzellen der Maus

Beim Southern-Blotting werden bestimmte DNA-Sequenzen aus einem komplexen DNA-Mix durch sondenbasierten Nachweis identifiziert.

Um homologe Rekombinations- oder HR-Ereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern-Blotting zu identifizieren, erhalten Sie genomische DNA aus den Zellen. Inkubieren Sie mit einem Restriktionsenzym, um die DNA in kleinere Fragmente zu verdauen.

Laden Sie die DNA auf ein Agarose-Gel. Führen Sie eine Elektrophorese für die größenbasierte Fragmenttrennung durch.

Behandeln Sie das Gel mit einer sauren Lösung, um Purinbasen zu entfernen und die doppelsträngige DNA, dsDNA, zu lösen. Alkalische Denaturierungslösung zugeben. Der hohe pH-Wert stört die Wasserstoffbrückenbindungen und denaturiert die gelöste dsDNA in einzelsträngige DNA, ssDNA. Inkubieren Sie mit einer neutralisierenden Lösung, um den pH-Wert des Gels zu neutralisieren.

Bauen Sie das Transfersystem aus Löschpapier, einer Nylonmembran und Gel zusammen, die auf der Membran gestapelt sind. Führen Sie die Übertragung durch. Die ssDNA wird vom Gel über die Kapillarwirkung nach unten auf die Membran übertragen.

Bestrahlen Sie die Membran mit ultravioletten Strahlen, vernetzen und immobilisieren Sie die DNA. Legen Sie die Membran in ein Röhrchen, das eine Hybridisierungslösung enthält. Inkubieren Sie mit Rotation, beschichten Sie die Membran und verhindern Sie eine unspezifische Sondenbindung.

Inkubieren Sie schließlich die Membran mit dem Hybridisierungspuffer, der einzelsträngige, radioaktiv markierte Sonden enthält. Die Sonden binden über Sequenzkomplementarität an bestimmte DNA-Regionen.

Waschen Sie die Membran und entfernen Sie die ungebundenen Sonden. Setzen Sie die Membran Röntgenstrahlen aus. Unterschiedliche Banden auf der Membran unterscheiden DNA-Regionen, die HR-Ereignisse enthalten, von Kontrollregionen.

Mischen Sie für jede gDNA 30 Mikroliter 10-fachen Puffer für Dra I, drei Mikroliter Dra I und 10 Mikrogramm gDNAs pro Probe. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das endgültige Volumen 30 Mikroliter beträgt, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die gDNAs zu verdauen.

Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Elektrophorese-Gel mit Ethidiumbromid vor. Laden Sie die zuvor aufgenommenen Proben zusammen mit einer 1-KB-Leiter auf das Gel und lassen Sie es über Nacht mit 30 bis 40 Volt laufen. Am nächsten Tag weichen Sie das Gel in einer Schale ein, die eine 0,2 Newton Salzsäurelösung enthält. Schütteln Sie das Tablett mit einem Shaker 20 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie das Gel in eine Schale mit einer DNA-denaturierenden Lösung. Schütteln Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur leicht. Geben Sie dann das Gel in eine Schale mit einer DNA-neutralisierenden Lösung und schütteln Sie es vorsichtig 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Mit einem schnellen Abwärtstransfersystem übertragen Sie die DNAs vom Gel auf die Membran.

Montieren Sie als Nächstes den TurboBlotter und den Blotting-Stack, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Nehmen Sie danach die Membran heraus und waschen Sie sie eine Minute lang mit 2X Kochsalz-Natriumcitrat. Nehmen Sie die Flüssigkeit mit dem Gewebe auf und verwenden Sie dann einen UV-Vernetzer, um die DNA mit der Membran zu vernetzen.

Um mit der Markierung der DNA-Sonden mit Radioaktivität zu beginnen, geben Sie die hitzevergällten Sonden-DNAs in das Röhrchen mit den gebrauchsfertigen DNA-Markierungskügelchen. Pipettieren Sie zum Mischen auf und ab und fügen Sie 5 Mikroliter radioaktiv markiertes Desoxycytosintriphosphat hinzu. Inkubieren Sie eine Viertelstunde lang bei 37 Grad Celsius. Reinigen Sie die markierten Sonden mit G-50-Mikrosäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um die Radioaktivität zu messen.

Um mit der Hybridisierung der Membranen mit den markierten Sonden zu beginnen, setzen Sie die Membran in das Hybridisierungsröhrchen ein. Fügen Sie die gemischte Vorhybridisierungslösung hinzu. Legen Sie das Röhrchen in den Hybridisierungsofen und lassen Sie die Vorhybridisierung 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius ablaufen.

Nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Ofen und gießen Sie die Prähybridisierungslösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie die denaturierte Sonde hinzu und mischen Sie vorsichtig. Geben Sie die gemischte Hybridisierungslösung in das Hybridisierungsröhrchen und stellen Sie das Röhrchen wieder in den Hybridisierungsofen. Lassen Sie dann die Hybridisierung über Nacht stattfinden.

Um die nicht-hybridisierten Sonden zu entfernen, legen Sie die Membran in eine Schale mit 1x Kochsalz-Natriumcitrat mit 0,1 % SDS und schütteln Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig bei 55 bis 60 Grad Celsius. Wickeln Sie danach die Membran mit Plastikfolie ein und befestigen Sie sie in der Belichtungskassette. Setzen Sie die Membran in einem dunklen Raum 2 Blatt Röntgenfilm aus. Entwickeln Sie den Film, um die Ergebnisse zu visualisieren.