Northern Blot zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer microRNA im Gesamt-RNA-Extrakt von Pflanzengewebe

MicroRNAs, miRNAs, sind kleine, einzelsträngige, nicht-kodierende RNAs. miRNA baut sich in einen Multiproteinkomplex ein und bindet weiter an komplementäre Ziel-mRNA-Sequenzen, um die Genexpression negativ zu regulieren.

Um spezifische miRNA aus der Gesamt-RNA aus Pflanzengeweben nachzuweisen, fügen Sie einen Gel-Loading-Farbstoff hinzu, der Tracking-Farbstoffe und Formamid – ein RNA-Denaturierungsmittel – enthält. Erhitzen Sie die Probe, um die RNA zu denaturieren und die Bildung von Sekundärstrukturen vor der Elektrophorese zu verhindern.

Laden Sie die Probe und die Standard-RNA-Marker in die Vertiefungen eines vormontierten denaturierenden Polyacrylamidgels. Führen Sie eine Elektrophorese durch, die die größenbasierte Trennung von RNA-Fragmenten erleichtert.

Übertragen Sie das Gel auf vornasses Filterpapier auf einer Elektrolöschkassette. Richten Sie eine mit Puffern getränkte Nylon-Blotting-Membran über dem Gel aus. Stapeln Sie dann die vornassen Filterpapiere. Führen Sie Elektroblotting durch.

Der elektrische Strom bewirkt, dass sich die negativ geladene RNA, einschließlich der miRNA, aus dem Gel auf die positiv geladene Nylonmembranoberfläche bewegt. Setzen Sie die Membran ultraviolettem Licht aus. Dadurch werden die RNAs mit der Membran vernetzt und so ein RNA-Verlust verhindert.

Inkubieren Sie die Membran in einem Hybridisierungspuffer, der Blockierungsmittel enthält, die die unspezifischen Bindungsstellen einnehmen, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.

Fügen Sie eine radioaktiv markierte RNA-Oligonukleotidsonde hinzu, die komplementär zur Ziel-miRNA ist, um spezifisch an diese zu binden. Waschen Sie die Membran mit Puffer und entfernen Sie die ungebundenen Sonden.

Verwenden Sie ein Phosphor-Bildgebungssystem, um die Signalintensitäten der radioaktiven Hybridisierung zu erfassen und zu quantifizieren. Das hochauflösende Signal deutet auf eine spezifische miRNA-Expression im Pflanzengewebe hin.

Stoppen Sie den Vorlauf des Gels.

Waschen Sie die Vertiefungen gründlich, bevor Sie die Probe laden, um Ablagerungen des Harnstoffs in den Vertiefungen zu entfernen. Erhitzen Sie die resuspendierten RNA-Proben 1 Minute lang bei 98 Grad. Laden Sie die Proben mit Kapillarspitzen heiß in die Vertiefungen. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen.

Schließen Sie das Laden aller Proben ab und montieren Sie den Deckel. Lassen Sie das Gel 3 Stunden lang bei 80 Volt laufen oder bis das Bromphenolblau vollständig aufgebraucht ist. Verwenden Sie für den Transfer eine positiv geladene Nylonmembran. Schneiden Sie es auf die Abmessungen der Glasplatte zu. Beschriften Sie die Membran in der oberen rechten Ecke. Legen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberfläche von sterilem Milli-Q Wasser. Achten Sie darauf, dass Sie das Etikett mit der Seite nach unten zur Wasseroberfläche hin platzieren.

Nehmen Sie ein sauberes Tablett und bereiten Sie das Gelsandwich für die Elektroübertragung vor. Legen Sie die graue Seite der Kassette nach unten. Gießen Sie 1X TBE etwas über das Niveau der Kassette. Befeuchten Sie das Faserpad mit 1X FSME und drücken Sie es zusammen, um Luftblasen zu entfernen. Schneide zwei Stücke Löschpapier auf die Größe eines Faserpads zu.

Befeuchten Sie ein Stück Löschpapier in 1X TBE vor und legen Sie es über das Faserpad. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie eine Plastikpipette über das Papier rollen. Befeuchten Sie ein weiteres Stück Löschpapier in einer 1X TBE vor und legen Sie es über die Kassette. Rollover, um Luftblasen zu entfernen. Nun ist das Sandwich-Setup bereit für den Elektrotransfer.

Nach Beendigung der Elektrophorese stoppen Sie den Lauf und entfernen Sie den Deckel vom Gerät. Entfernen Sie die laufende Kassette aus dem Setup. Nehmen Sie die Glasplatten aus der Laufkassette.

Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Baugruppe. Legen Sie es so über das Löschpapier, dass sich die erste geladene RNA-Probe zu Ihrer Rechten befindet. Tauchen Sie die vorgetränkte Membran vorsichtig in 1X FSME und legen Sie sie mit der Etikettenseite nach unten über das Gel. Lassen Sie die Membran und das Gel nicht trocknen. Vorsichtig umdrehen, um Luftblasen zu entfernen.

Tauchen Sie ein Stück Löschpapier in 1X TBE und legen Sie es über die Membran. Entfernen Sie Luftblasen. Legen Sie ein weiteres Blatt Löschpapier auf und entfernen Sie die Luftblasen. Vervollständigen Sie das Sandwich, indem Sie das Faserpad über die Baugruppe legen. Schließen Sie die Kassette fest.

Setzen Sie die Transblot-Kassette in das Modul ein. Füllen Sie den Tank mit 1X FSME, pH 8,2, bis zur Löschmarke. Schließen Sie den Deckel des Gerätes und übertragen Sie es bei 10 Volt über Nacht bei 4 Grad oder in einen kalten Raum. Halten Sie den UV-Vernetzer bereit und stellen Sie ihn kurz vor Abschluss des Elektrotransfers auf 1.200 ein.

Entfernen Sie nach Abschluss der Übertragung die Kassette aus dem Modul. Legen Sie die feuchte Folie auf ein A4-Blatt und legen Sie die markierte Seite nach oben. Vernetzen Sie die RNA mit der Membran durch Bestrahlung mit 254 Nanometer UV-Licht bei 120 Millijoule. Der vernetzte Blot kann bei 4 Grad gelagert oder zur Hybridisierung verwendet werden.

Entwerfen Sie eine Sonde, die vollständig komplementär zu der kleinen RNA ist, die nachgewiesen werden muss, und markieren Sie die Sonde an ihrem 5-Prime-Ende mit dem PNK-Enzym und kombinieren Sie die Komponenten wie gezeigt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert.

Nach 30 Minuten Inkubation verwenden Sie G-25-Säulen, um unmarkierte Sonden von der Reaktionsmischung zu trennen. Um die Beschriftung der Sonde zu verbessern, bereiten Sie die G-25-Säule vor der Verwendung vor. Legen Sie den Blot mit der RNA-Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche. Mischen Sie den Hybridisierungspuffer vor der Verwendung kräftig. Fügen Sie 10 ml Hybridisierungspuffer hinzu und stellen Sie die Hybridisierungsflasche in einen Hybridisierungsofen, der bei einer Drehung von 35 Grad gehalten wird.

Führen Sie die Vorhybridisierung für 20 bis 30 Minuten durch. Nehmen Sie die Flasche nach der Prähybridisierung aus dem Ofen. Geben Sie die markierte Sonde vorsichtig in den Hybridisierungspuffer. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Inkubieren Sie den Klecks im Ofen bei 35 Grad mit Drehung für 12 Stunden.

Entfernen Sie nach der Hybridisierung den Hybridisierungspuffer aus der Flasche. Führen Sie eine schnelle Reinigung der Kleckse mit Waschpuffer I durch. Dieser Schritt wird durchgeführt, um überschüssige Hybridisierungslösung aus den Blots zu entfernen. Inkubieren Sie die Blots 30 Minuten lang bei 35 Grad mit Waschpuffer I. Führen Sie eine weitere Wäsche mit Puffer II bei 35 Grad für 30 Minuten durch.

Nachdem Du den Blot abgewaschen hast, lege ihn in eine Hybridisierungsabdeckung, entferne überschüssigen Puffer und versiegele ihn. Legen Sie es in eine Kassette und setzen Sie es 12 Stunden lang einem strahlungsfreien Phosphor-Imager-Bildschirm aus. Erkennen Sie das Hybridisierungssignal mit dem Typhoon Biomolecular Imager und analysieren Sie die Ergebnisse mit der ImageJ-Software.