Graphen-Biosensor-basierte Feldeffekt-Biosensorik zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Protein-Protein-Wechselwirkungen, PPIs, sind entscheidend für die Regulierung der meisten biologischen Prozesse.

Um PPIs mithilfe von Feldeffekt-Biosensorik zu detektieren, beginnen Sie mit einem Graphen-Feldeffekttransistorchip. Der Chip besteht aus einer Carboxyl-funktionalisierten Graphenoberfläche als halbleitendem Kanal zwischen der Source- und der Drain-Elektrode.

Inkubieren Sie den Chip mit einer frischen Lösung aus Carbodiimid und N-Hydroxysulfosuccinimid, Sulfo-NHS, in einem Zwitterion-Puffer. Dieser Puffer erzeugt einen geeigneten pH-Wert, der es Carbodiimid und Sulfo-NHS ermöglicht, die funktionalisierten Carboxylgruppen des Chips zu aktivieren und aminreaktive Ester zu bilden.

Fügen Sie die Zielproteinlösung hinzu. Die primären Amine reagieren mit den aminreaktiven Estern und immobilisieren die Proteine auf dem Chip durch Amidbindungsbildung. Fügen Sie eine aminhaltige Quenchlösung hinzu, um ungebundene aminreaktive Ester zu blockieren und eine unspezifische Bindung zu verhindern.

Setzen Sie den Chip in das elektronische Lesegerät ein und kalibrieren Sie ihn mit einem Puffer. Das Lesegerät legt eine konstante Spannung zwischen den Elektroden an. Gemessen wird der resultierende elektrische Stromfluss zwischen den Elektroden im analytungebundenen Zustand.

Fügen Sie die niedrigste Analytkonzentration hinzu. Die Wechselwirkung zwischen Analytproteinen und den auf dem Chip immobilisierten Zielen verändert die lokale Ladungsverteilung der Graphenoberfläche, die als I-Antwort aufgezeichnet wird – die Änderung des Stromflusses zwischen den Elektroden.

Nach der Aufzeichnung mit einem Puffer waschen, um die gebundenen Analyten zu dissoziieren. Wiederholen Sie die Analyse mit steigenden Analytkonzentrationen.

Ein allmählicher Anstieg der I-Antwort mit steigenden Analytkonzentrationen deutet auf starke PPIs zwischen dem Ziel und dem Analyten hin.

Beginnen Sie mit dem Mischen gleicher Volumina von EDC- und Sulfo-NHS-Lösung, indem Sie auf und ab pipettieren. Legen Sie die vom Unternehmen gelieferten Biosensor-Chips in eine gläserne Petrischale mit passendem Deckel. Es wird empfohlen, alle Funktionalisierungsschritte, die an der Chipaktivierung beteiligt sind, in der Petrischale durchzuführen. Tragen Sie 50 Mikroliter 1 molaren MES-Puffer auf den Biosensor-Chip auf. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren.

Aspirieren Sie dann den Puffer und tragen Sie sofort 50 Mikroliter EDC/Sulfo-NHS-Lösung auf den Sensorchip auf. Decken Sie die Petrischale ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die EDC/Sulfo-NHS-Lösung aus dem Chip und tragen Sie 50 Mikroliter 1 molaren MES-Puffer auf.

Aspirieren Sie den MES-Puffer und spülen Sie den Chip zweimal mit 50 Mikrolitern 1x PBS. Aspirieren Sie das PBS aus dem Chip und fügen Sie das Zielmolekül Hsp90 hinzu. Decken Sie die gläserne Petrischale ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann die Lösung, die das Zielmolekül enthält, und spülen Sie dreimal mit 50 Mikrolitern 1x PBS.

Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus dem Chip und fügen Sie 50 Mikroliter der Quench 1-Lösung hinzu. Decken Sie die Petrischale aus Glas ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Lösung Quench 1 aus dem Chip und fügen Sie 50 Mikroliter der Lösung Quench 2 hinzu. Decken Sie die Petrischale aus Glas ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie danach die Quench 2-Lösung aus dem Chip ab und spülen Sie den Chip fünfmal mit 50 Mikrolitern 1X PBS aus, wobei das letzte PBS-Tröpfchen auf dem Sensor verbleibt.

Bereiten Sie die Analytverdünnungsreihe für Cdc37 im gewünschten Konzentrationsbereich vor. Entwerfen Sie das Experiment so, dass es mindestens acht verschiedene Analytkonzentrationen umfasst, um eine zuverlässige Dissoziationskonstante oder einen K_d-Wert zu erhalten, und bereiten Sie diese verschiedenen Verdünnungen in demselben Puffer vor, der für die Kalibrierung und das Zielprotein verwendet wird.

Setzen Sie den Chip vorsichtig in das Instrument ein. Vergewissern Sie sich, dass die Software eingeschaltet ist und die LED-LED grün leuchtet. Drücken Sie anschließend auf das Modul "Run Experiment" in der automatisierten Software und wählen Sie "10 Points With Regeneration" oder ein anderes gewünschtes Protokoll. Geben Sie die Details ein, z. B. den Namen des Bedieners, den Namen des Experiments, das Datum, den Regenerationspuffer, das immobilisierte Ziel und den Analyten in Lösung. Drücken Sie die in der Software angezeigte Schaltfläche "Experiment starten" und folgen Sie den Anweisungen der automatisierten Software.

Um die Gerätekalibrierung durchzuführen, saugen Sie die restliche PBS-Lösung aus dem Chip an und tragen Sie 50 Mikroliter des Kalibrierpuffers auf. Drücken Sie die Schaltfläche "Weiter" und warten Sie fünf Minuten, bis der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den für den Kalibrierungsschritt ermittelten Endpunkt mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.

Führen Sie als Nächstes eine Analyt-Assoziation durch, indem Sie den Kalibrierpuffer vom Chip absaugen und 50 Mikroliter der niedrigsten Analytkonzentration auftragen. Drücken Sie die Schaltfläche "Weiter" und warten Sie fünf Minuten, bis der Zuordnungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Assoziationsschritt mit einem Warnalarm an, um fortzufahren.

Um eine Analytdissoziation durchzuführen, aspirieren Sie die Analytlösung aus dem Chip und tragen Sie 50 Mikroliter des Dissoziationspuffers auf. Drücken Sie die Schaltfläche "Weiter". Nach der Dauer des Dissoziationsschritts zeigt die Software den Endpunkt für den Dissoziationsschritt mit einem Warnalarm an.

Führen Sie als Nächstes die Chipregeneration durch, indem Sie die Dissoziationslösung aus dem Chip aspirieren und 50 Mikroliter des Regenerationspuffers auftragen. Drücken Sie dann die Schaltfläche "Weiter". Der Regenerationsschritt dauert in der Regel etwa 30 Sekunden. Danach zeigt die Software den Endpunkt für den Regenerationsschritt mit dem Warnalarm zur Nachverfolgung an.

Zum Waschen des Späns saugen Sie schließlich die Regenerationslösung aus dem Chip ab und tragen Sie 50 Mikroliter des Waschpuffers auf. Saugen Sie die Lösung aus dem Chip ab und wiederholen Sie dies fünfmal. Lassen Sie den letzten Tropfen des Waschpuffers auf dem Chip. Drücken Sie dann die Taste "Weiter" und warten Sie 30 Sekunden, bis die Dauer des Waschschritts in der Softwareanzeige beendet ist.

Wiederholen Sie die Schritte für jede verwendete Analytkonzentration. Die fünf Schritte der Kalibrierung, der Analyt-Assoziation, der Dissoziation, der Regeneration und des fünfmaligen Waschens bilden einen Zyklus.