Massenphotometrie zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen auf Einzelmolekülebene

Um Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen mittels Massenphotometrie nachzuweisen, inkubieren Sie zunächst die gewünschte Konzentration an gereinigten Antigenen und Antikörpern für den erforderlichen Zeitraum, um die Antigen-Antikörper-Bindung zu erleichtern. Basierend auf der Stöchiometrie der Antigenbindung können die Paratopregionen dieser Antikörper eine unterschiedliche Anzahl von angehängten Antigenen aufweisen.

Die Lösung, die die freien Antikörper enthält, wird zusammen mit den Antigen-Antikörper-Komplexen durch eine vormontierte Durchflusskammer einfließen. Befestigen Sie die Kammer auf dem Mikroskoptisch eines Massenphotometers. Richten Sie dann den Laserstrahl durch die Strömungskammer, um eine optimale Bildgebung zu erzielen.

Abhängig von der Anzahl der an jeden Antikörper angehängten Antigene ändert sich die Molekülmasse der Komplexe. Diese Schwankungen in der Masse führen dazu, dass die Komplexe das Licht unterschiedlich streuen.

Komplexe mit höheren Molekülmassen, bei denen zwei Antigene an beide Paratope eines einzigen Antikörpers gebunden sind, streuen mehr Licht im Vergleich zu einzelnen antigenhaltigen Komplexen. Darüber hinaus weisen freie Antikörper die geringste Lichtstreuung auf.

Ein Detektor sammelt das Streulicht und misst dessen Frequenz und Intensität. Das Photometer erfasst Fluktuationen im Streulicht als Interferenzmuster und stellt dies als Flecken dar.

Schwache Flecken entsprechen freien Antikörpern. Im Gegensatz dazu stellen sehr dunkle Flecken Komplexe mit zwei Antigenen dar, und der weniger dunkle Fleck enthält ein gebundenes Antigen.

Das Vorhandensein von dunklen Flecken entspricht den Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen.

Um die Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie zu beurteilen, tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Immersionsöl auf das Instrumentenobjektiv auf und stellen Sie die Durchflusskammer auf den Tisch des Mikroskops. Geben Sie 10 Mikroliter gefiltertes PBS an ein Ende des Durchflusskammerkanals. Der Puffer tritt durch Kapillarwirkung in den Kanal ein.

Verwenden Sie auf der Registerkarte "Fokussteuerung" der Datenerfassungssoftware die Tasten für die Grobtischbewegung nach oben und unten, um die ersten Einstellungen vorzunehmen, und klicken Sie auf "Schärfe", um die Anzeige des Schärfesignals anzuzeigen. Verwenden Sie die feinen Einstelltasten nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren, und klicken Sie auf Fokus einstellen und Fokus sperren, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren. Ein Bild einer sauberen Folie sollte einen "Signal"-Wert von 0,05 % oder weniger haben.

Laden Sie 20 Mikroliter der ersten Antikörper-Antigen-Probe wie gezeigt und tupfen Sie die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Löschpapier ab. Klicken Sie unmittelbar nach dem Laden auf Aufzeichnen, um die entsprechende Anzahl von Frames zu erfassen, die 100 Sekunden Daten entspricht. Geben Sie am Ende des Datenerfassungszeitraums einen Dateinamen für die Daten ein, und klicken Sie auf OK und dann auf Beispiel, um die Datei zu speichern.

Um die Massenphotometriedaten zu analysieren, öffnen Sie die gewünschte Datei und klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie auf Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden, und klicken Sie auf Datei und Ergebnisse speichern unter, um die analysierten Daten zu speichern.

Um die relativen Konzentrationen jeder Spezies in der Probe zu erhalten, öffnen Sie die Datei "eventsFitted.csv", kopieren Sie die Daten in Spalte M in die entsprechende Plot- und Analysesoftware und verwenden Sie die Funktion Plot/Statistics/Histogram, um die Molekülmassenverteilung darzustellen. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Fenster Zeichnungseigenschaften zu öffnen, deaktivieren Sie die automatische Binning und wählen Sie eine Bin-Größe von 2,5 KiloDalton.

Um die Bin-Center- und Zähldaten zu erstellen, klicken Sie auf Übernehmen und los. Um das Histogramm an die Gaußschen Funktionen anzupassen, wählen Sie die Spalten "Bin-Mittelpunkte" und "Anzahl" aus und klicken Sie auf die Menüfunktionen "Analyse/Peaks" und "Baseline/Multiple Peak Fit". Doppelklicken Sie, um die ungefähren Peakpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie auf NLFit öffnen.

Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Fix für die "xc"-Zentren und setzen Sie deren Werte auf die erwarteten Molekülmassen des freien Antikörpers und der Einzel- und Doppelantigen-Antikörper-Komplexe. Aktivieren Sie die Option Freigeben für die Breitenparameter und klicken Sie auf Anpassen.

Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Spezies in der Probe dar. Verwenden Sie dann die Gleichung, um den Konzentrationsanteil jeder Spezies aus den Werten für die Spitzenhöhe zu berechnen.