FLIM-FRET-Bildgebung zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien

Um spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien mit Hilfe der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zu untersuchen, wird in Kombination mit dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zunächst eine rekombinante Bakteriensuspension verwendet. Die Bakterien exprimieren spezifische zytoplasmatische Proteine, die an Stoffwechselwegen beteiligt sind und mit fluoreszierenden Donor- und Akzeptorproteinen markiert sind, die für FRET geeignet sind.

Spotten Sie die Bakteriensuspension auf einem Agarose-Pad, das die Bakterien auf einem Objektträger immobilisiert. Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und verschließen Sie es.

Positionieren Sie den Objektträger auf dem Tisch eines inversen Rastermikroskops mit Zwei-Photonen-Anregung für die FLIM-FRET-Mikroskopie. Verwenden Sie eine Fluoreszenzlampe, um einen Bereich von Interesse auf der bakteriellen Monoschicht auszuwählen und zu scannen.

Die Wechselwirkung zwischen den exprimierten zytoplasmatischen Proteinen bringt die fluoreszierenden Donor- und Akzeptorproteine in geeigneter Orientierung näher zusammen. Bei der Laserbeleuchtung mit einer geeigneten Wellenlänge wird das fluoreszierende Donorprotein