JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:49 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie den Proximity-Ligations-Assay, indem Sie präparierte Nematoden entnehmen und sie mit freigelegten Keimbahnzellen auf einem Objektträger fixieren. Diese Zellen weisen einen hohen Gehalt an Ribonukleoproteinkomplexen auf, die RNA-bindende Proteine, RBPs, enthalten, die mit ihren Partnerproteinen assoziiert sind.
Überlagern Sie den Objektträger mit zwei primären Antikörpern, die zwei spezifische Zielproteine erkennen – das RBP und sein Partnerprotein. Ergänzen Sie den Objektträger mit zwei Arten von Sekundärantikörpern, die für ihre jeweiligen Primärantikörper spezifisch sind.
Jeder Sekundärantikörper ist mit PLA-Sonden konjugiert – DNA-Stränge mit komplementären Sequenzen. Die Sekundärantikörper binden an die vorgebundenen Primärantikörper und bringen die beiden PLA-Sonden in die Nähe.
Tragen Sie den Ligationspuffer auf, der Konnektor-Oligonukleotide enthält, die mit PLA-Sonden hybridisieren, und das Ligase-Enzym versiegelt die Lücke und erzeugt zirkuläre DNA. Inkubieren Sie den Objektträger mit einer Amplifikationslösung, die DNA-Polymerase, dNTPs und Detektorsonden enthält, die an einem roten Fluorophor befestigt sind.
Unter Verwendung der zirkularisierten DNA als Matrize initiiert die Polymerase eine Rolling-Circle-Amplifikation und erzeugt viele Kopien der Matrizen-DNA, die miteinander verbunden sind. Die amplifizierte DNA bleibt an die PLA-Sonde gebunden und ermöglicht so die Lokalisierung von Protein-Protein-Interaktionen.
Die Detektorsonden, die kurze einzelsträngige Oligonukleotide tragen, interagieren mit den komplementären Regionen der amplifizierten DNA, bilden Duplexe und geben Fluoreszenzsignale an Proteinkomplexe weiter. Bilden Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop ab.
Achten Sie auf deutliche rote Flecken innerhalb der Zelle, die auf erfolgreiche Protein-Protein-Wechselwirkungen hinweisen.
Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel, um die Primärantikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung pro 14 x 14 Millimeter großen Abstand auf die Objektträger auf. Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Waschen Sie die Objektträger morgens zweimal für je 5 Minuten mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist. Legen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer vom Objektträger abläuft, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab.
Bereiten Sie eine 40-Mikroliter-Lösung vor, die Plus- und Minussonden enthält. Geben Sie die Lösung in jeden 14 x 14 Millimeter großen Raum. Inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger zweimal für je 5 Minuten mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas.
Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist. Verdünnen Sie den Ligationspuffer 1 bis 5 mit Reinstwasser. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase 1 bis 40 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand an Ligationslösung herzustellen. Lege die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von den Seiten ablaufen kann, und wische die Ränder vorsichtig ab.
Geben Sie 40 Mikroliter der Ligaturlösung in jeden 14 x 14 Millimeter großen Raum. Inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Waschen und Trocknen der Objektträger wie zuvor beschrieben werden je 40 Mikroliter frisch zubereitete lichtgeschützte Amplifikationslösung in einen Abstand von 14 x 14 Millimetern geben.
Inkubieren Sie die Objektträger in der feuchten dunklen Kammer für 1 Stunde und 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger zweimal für je 10 Minuten mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer B und waschen Sie die Objektträger einmal 1 Minute lang mit 50 Millilitern 0,01x Waschpuffer B.
Nachdem Sie den epoxidbeschichteten Umfang des Objektträgers gezeichnet haben, fügen Sie jeder Probe 10 Mikroliter Eindeckmedium hinzu und legen Sie vorsichtig ein Deckglas darauf, damit sich das Eindeckmedium ausbreiten kann. Malen Sie den Rand des Deckglases mit Nagellack an, um das Deckglas und den Gleiter zu versiegeln. Vermeiden Sie es, das Deckglas zu bewegen. Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt aushärten.