Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

Beginnen Sie den Proximity-Ligations-Assay, indem Sie präparierte Nematoden entnehmen und sie mit freigelegten Keimbahnzellen auf einem Objektträger fixieren. Diese Zellen weisen einen hohen Gehalt an Ribonukleoproteinkomplexen auf, die RNA-bindende Proteine, RBPs, enthalten, die mit ihren Partnerproteinen assoziiert sind.

Überlagern Sie den Objektträger mit zwei primären Antikörpern, die zwei spezifische Zielproteine erkennen – das RBP und sein Partnerprotein. Ergänzen Sie den Objektträger mit zwei Arten von Sekundärantikörpern, die für ihre jeweiligen Primärantikörper spezifisch sind.

Jeder Sekundärantikörper ist mit PLA-Sonden konjugiert – DNA-Stränge mit komplementären Sequenzen. Die Sekundärantikörper binden an die vorgebundenen Primärantikörper und bringen die beiden PLA-Sonden in die Nähe.

Tragen Sie den Ligationspuffer auf, der Konnektor-Oligonukleotide enthält, die mit PLA-Sonden hybridisieren, und das Ligase-Enzym versiegelt die Lücke und erzeugt zirkuläre DNA. Inkubieren Sie den Objektträger mit einer Amplifikationslösung, die DNA-Polymerase, dNTPs und Detektorsonden enthält, die an einem roten Fluorophor befestigt sind.

Unter Verwendung der zirkularisierten DNA als Matr