Immunpräzipitationsassay zur Untersuchung von Enzymrezeptor-Wechselwirkungen in transfizierten Zellen

PD-1, ein Zelloberflächenrezeptorprotein, enthält zwei zytoplasmatische Tyrosin-Motive – das inhibitorische Motiv, ITIM, und das Schaltermotiv, ITSM. Die Ligandenbindung induziert die ITIM- und ITSM-Phosphorylierung und die Rekrutierung des Tyrosinphosphatase-Proteins SHP2 an die zytoplasmatische Domäne von PD-1, wodurch eine nachgeschaltete Signalkaskade ausgelöst wird.

Um SHP2-PD-1-Wechselwirkungen über einen Co-Immunpräzipitations-Assay zu untersuchen, erhalten Sie eine adhärente Epithelzellkultur. Diese Zellen exprimieren grün fluoreszierendes Protein, GFP-markiertes Wildtyp-PD-1 mit phosphoryliertem ITIM und ITSM. Es werden Epithelzellen erhalten, die GFP-markierte mutierte PD-1 exprimieren, wobei ITIM- oder ITSM-Mutationen ihre Phosphorylierung hemmen.

Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, der Detergens und Natriumorthovanadat enthält. Die Detergenzien lysieren die Zellen und bewirken die Freisetzung von GFP-markierten PD-1-Proteinen. Natriumorthovanadat blockiert freigesetzte Phosphatasen und verhindert so die Dephosphorylierung von ITIM und ITSM.

Zentrifugieren Sie das Lysat. Den proteinhaltigen Überstand in frische Röhrchen überführen. Fügen Sie mit Anti-GFP-Antikörpern beschi