Immunpräzipitationsassay zur Untersuchung von Enzymrezeptor-Wechselwirkungen in transfizierten Zellen

PD-1, ein Zelloberflächenrezeptorprotein, enthält zwei zytoplasmatische Tyrosin-Motive – das inhibitorische Motiv, ITIM, und das Schaltermotiv, ITSM. Die Ligandenbindung induziert die ITIM- und ITSM-Phosphorylierung und die Rekrutierung des Tyrosinphosphatase-Proteins SHP2 an die zytoplasmatische Domäne von PD-1, wodurch eine nachgeschaltete Signalkaskade ausgelöst wird.

Um SHP2-PD-1-Wechselwirkungen über einen Co-Immunpräzipitations-Assay zu untersuchen, erhalten Sie eine adhärente Epithelzellkultur. Diese Zellen exprimieren grün fluoreszierendes Protein, GFP-markiertes Wildtyp-PD-1 mit phosphoryliertem ITIM und ITSM. Es werden Epithelzellen erhalten, die GFP-markierte mutierte PD-1 exprimieren, wobei ITIM- oder ITSM-Mutationen ihre Phosphorylierung hemmen.

Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, der Detergens und Natriumorthovanadat enthält. Die Detergenzien lysieren die Zellen und bewirken die Freisetzung von GFP-markierten PD-1-Proteinen. Natriumorthovanadat blockiert freigesetzte Phosphatasen und verhindert so die Dephosphorylierung von ITIM und ITSM.

Zentrifugieren Sie das Lysat. Den proteinhaltigen Überstand in frische Röhrchen überführen. Fügen Sie mit Anti-GFP-Antikörpern beschichtete Agarosekügelchen hinzu. Die GFP-markierten PD-1-Proteine binden an die Anti-GFP-Antikörper.

Inkubieren Sie mit der SHP2-Suspension. Das bead-gebundene PD-1-GFP bindet SHP2 über das phosphorylierte ITIM und ITSM.

Laemmli-Puffer zugeben und so kochen, dass die Reduktions- und Detergenzien im Puffer die PD-1-GFP-SHP2-Proteinkomplexe denaturieren. Zentrifugieren und sammeln Sie den Überstand mit den denaturierten Proteinkomplexen. Führen Sie SDS-PAGE und Western Blot durch.

Wildtyp- und ITIM-mutiertes PD-1 interagiert mit SHP2. ITSM-Mutanten können SHP2 nicht binden, was darauf hindeutet, dass die PD1-SHP2-Interaktion phosphoryliertes ITSM erfordert.

Bei der Durchführung der Immunpräzipitation sollten alle Schritte entweder auf Eis oder bei 4 Grad Celsius durchgeführt werden. Ergänzen Sie den Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren, indem Sie eine Tablette der Inhibitoren in 10 Millilitern Puffer auflösen. Fügen Sie außerdem 1 Millimolar Natriumorthovanadat zu dem Puffer hinzu, der auf den PD1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird. Geben Sie 500 Mikroliter eiskalten Lysepuffer in die Zellen und achten Sie darauf, dass der Lysepuffer mit dem Natriumorthovanadat nur auf die Platten mit PD1-GFP-transfizierten Zellen gegeben wird.

Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sofort von den Platten zu entfernen und zu sammeln. Füllen Sie die Lysate in 1,5-Milliliter-Kaltrohre und drehen Sie sie 30 Minuten lang bei 0,005 g und bei 4 Grad Celsius. Um den Nachkernüberstand aus den Lysaten zu sammeln, drehen Sie ihn 10 Minuten lang bei 10.000 g und 4 Grad Celsius herunter.

Füllen Sie die Überstände in neue Röhrchen um und entsorgen Sie das Pellet. Bewahren Sie die Überstände für den zweiten Satz von sechs Platten auf Eis auf, um sie später mit WCL zu analysieren.

Um mit der Zubereitung von Anti-GFP-Kügelchen zu beginnen, schütteln Sie die Flasche mit den Kügelchen vor dem Öffnen vorsichtig, um ein Absetzen zu verhindern. Entfernen Sie 40 Mikroliter der Anti-GFP-Kügelchen aus der Gülle für jede Bedingung. Zentrifugieren Sie bei 500 mal g und 4 Grad Celsius für 3 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, um die Kügelchen zu waschen, und achten Sie darauf, den Kontakt zwischen der Pipette und den Kügelchen zu minimieren, um einen Verlust zu vermeiden.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in 80 Mikrolitern Lysepuffer pro Probe. Geben Sie die gewaschenen Kügelchen direkt in das Zelllysat aus den PD1-GFP-exprimierenden Zellen des ersten Satzes von vier Platten. Drehen Sie 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit dem 0,005-fachen g, um die GFP-markierten Proteine immunauszufällen. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 1 Milliliter Kaltlysepuffer, der kein Orthovanadat enthält. Zentrifugieren Sie dann 10 Sekunden lang bei 2.500 g g.

Teilen Sie das Lysat des aktiven SHP2 aus dem ersten Satz Platten in drei gleiche Portionen und geben Sie einen Teil in jedes der drei Röhrchen, die die gewaschenen PD1-GFP-haltigen Kügelchen enthalten. Geben Sie 1/3 des Lysatvolumens aus den nicht transfizierten Zellen in das zweite Röhrchen der Wildtyp-PD1-GFP-Kügelchen. Die restlichen 2/3 ablegen.

Inkubieren Sie die Kügelchen 4 Stunden lang bei 4 Grad Celsius mit sanfter Drehung bei 0,005 mal g. Waschen Sie die Kügelchen danach zweimal mit 1 Milliliter Kaltlysepuffer für jede Wäsche. Geben Sie 80 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Probe und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen 100 Mikroliter beträgt. Piptieren Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze vorsichtig auf und ab, um zu mischen. Füllen Sie dann 50 Mikroliter aus jedem Röhrchen in zwei frische 1,5-Milliliter-Röhrchen um.

Schleudern Sie zuerst die Kügelchen bei 2.000 mal g und 4 Grad Celsius für 30 Sekunden herunter und entfernen Sie den Überstand. 20 Mikroliter 2x Laemmli Puffer dazugeben und fünf Minuten bei 95 Grad Celsius kochen lassen. Messen Sie mit einem BCA-Kit die Proteinkonzentration der Eingangskontrollen.

Übertragen Sie 30 Mikroliter der am stärksten verdünnten Probe in ein neues Röhrchen. Verwenden Sie einen Lysepuffer, um die restlichen Eingangskontrollen auf die gleiche Konzentration wie die am stärksten verdünnte Probe zu verdünnen. Übertragen Sie dann 30 Mikroliter jedes der verdünnten Eingangsregler in ein neues Röhrchen. Geben Sie gleiche Volumina von 2x Laemmli-Puffer zu den Lysaten und kochen Sie sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Danach schleudern Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang bei 2.000 g und 4 Grad Celsius herunter, bevor Sie die Western-Blot-Analyse durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben.