JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 6:15 Min. • July 8th, 2025
In Zellen binden Proteine über spezifische Sequenzen in ihrer Struktur an ihre interagierenden Proteine – und modulieren so die Funktion intrazellulärer Proteine.
Um intrazelluläre Proteininteraktionen zu erkennen, nehmen Sie eine adhärente Zellkultur. Saugen Sie das Medium an.
Fügen Sie ein biotinyliertes zellpenetrierendes Peptid, BCPP-Lösung, hinzu und inkubieren Sie.
Jedes BCPP enthält eine Peptidsequenz, die bei der spezifischen Bindung an das intrazelluläre Zielprotein hilft. Das Peptid hat ein zellpenetrierendes Peptid, CPP, am N-Terminus des Peptids und Biotin am C-Terminus für einen einfachen Nachweis.
Während der Inkubation erleichtert die positiv geladene CPP-Region den Eintritt des gebundenen Peptids durch die Zellmembran bis zum Zytoplasma. Das Peptid bindet an seinen intrazellulär interagierenden Proteinpartner und bildet einen BCPP-Zielproteinkomplex.
Fügen Sie einen Puffer hinzu, der Detergenzmoleküle enthält, die die Zellmembran aufreißen und BCPP-Zielproteinkomplexe und andere zelluläre Komponenten freisetzen.
Fügen Sie eine Lösung aus Agarose-bead-gebundenem Avidin hinzu – einem Glykoprotein, das spezifisch an das Biotin in BCPPs bindet. Inkubieren, wodurch die irreversible Bindung von Avidin an Biotin ermöglicht und Avidin-BCPP-Zielproteinkomplexe gereinigt werden.
Zentrifugieren Sie, um die Kügelchen zu pelletieren. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Puffer, um nicht-kovalente Bindungen zwischen den Proteinen zu spalten und CPP-Peptid-Protein-Komplexe von den Biotin-Avidin-Kügelchen zu eluieren.
Analysieren Sie die CPP-Peptid-Protein-Komplexe durch Western Blotting. Eine höhere Molekulargewichtsbande für den CPP-Peptid-Protein-Komplex als die Komponenten des Komplexes deutet auf eine erfolgreiche Interaktion zwischen den interagierenden Proteinpartnern hin.
Geben Sie das Volumen der Stammlösung von BCPP in die Zellkulturen, um die Konzentration zu erreichen, die sich als wirksam erwiesen hat.
Fügen Sie daher 92,8 Mikroliter à 2 Milligramm pro MilliliterTAT-Connexin-43-266-283-Biotin pro Milliliter Nährmedium hinzu. Legen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Wechselwirkungen zwischen dem BCPP und seinen intrazellulären Partnern stattfinden.
Um die Proteinextraktion durchzuführen, wird zunächst das Kulturmedium vollständig abgesaugt. Waschen Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro 150 Zentimeter, sehr vorsichtig, um eine Zellablösung zu vermeiden.
Um das Zelllysat zu erhalten, fügen Sie 3 Milliliter Lysepuffer pro 150-Quadratzentimeter-Kolben hinzu und kratzen Sie die Oberfläche mit einem Zellschaber gründlich ab. Wenn Sie den Kolben um etwa 45 Grad neigen, können Sie die Zelllysate leichter in die entsprechenden Röhrchen sammeln.
Gießen Sie 1 Milliliter des zellulären Lysats pro Röhrchen in 3 1,5-Milliliter-Röhrchen, die pro Bedingung gekennzeichnet sind. Für den Pull-Down zentrifugieren Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 11.000 x g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Übertragen Sie die Überstände auf neue Röhrchen mit der Bezeichnung A. Übertragen Sie ein Aliquot des Überstands pro Bedingung auf andere Röhrchen mit der Bezeichnung B. Dann 16,6 Mikroliter 4x Laemmli Puffer für 50 Mikroliter Lysat zugeben und bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Anschließend wird die NeutrAvidin-Agarose durch leichtes Schütteln sehr gut homogenisiert.
Schneiden Sie die Spitzen der Pipettenspitzen ab, um ihren Durchmesser zu vergrößern und das Pipettieren der Kügelchen zu verbessern. Geben Sie dann 50 Mikroliter NeutrAvidin-Agarose pro Milliliter Zelllysat in die A-Röhrchen. Inkubieren Sie die Zelllysate über Nacht bei 4 Grad Celsius unter sehr leichtem Schütteln, damit NeutrAvidin mit BCPPs, die an ihre intrazellulären Partner gebunden sind, interagieren kann.
Zentrifugieren Sie dann 1 Minute lang bei 4 % Grad Celsius bei 3.000 g g, um den Komplex von NeutrAvidin mit Proteinen zu sammeln. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände und füllen Sie sie in saubere Röhrchen mit der Bezeichnung C. Bewahren Sie sie auf, um sie für den Fall zu verwenden, dass das Herunterziehen nicht erfolgreich ist.
Um den Komplex von NeutrAvidin mit Proteinen zu waschen, fügen Sie den Pellets der A-Röhrchen frischen Lysepuffer hinzu. Das Pellet wird durch Inversion wieder suspendiert und die Zentrifugation wiederholt. Wiederholen Sie diese Wäsche noch fünf weitere Male. Alle diese Überstände können verworfen werden.
Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter 2x Laemmli-Puffer pro 1,5-Milliliter-Röhrchen für Pellets hinzu, die aus 150-Quadratzentimeter-Kolben mit konfluenten Zellen gewonnen werden. Dann eluieren Sie 5 Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen zu dissoziieren.
Nach der Elution 30 Sekunden lang bei 8.200 g zentrifugieren, um die NeutrAvidin-Kügelchen zu pelletieren. Übertragen Sie die Überstände, die die dissoziierten Proteine mit Kapillarspitzen enthalten, in neue, mit D markierte Röhrchen.
Diese Überstände sind nun bereit, in einen Western-Blot geladen zu werden, wie im Textprotokoll beschrieben, oder er kann bei minus 20 Grad Celsius eingefroren werden.