Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

Mit der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie kann der Oligomerisierungszustand von Proteinen in einer Probe bestimmt werden.

Nehmen Sie zunächst einen Objektträger mit Kammer, der eine fluoreszenzmarkierte Proteinmonomerlösung enthält. Legen Sie den Objektträger unter ein konfokales Mikroskop. Fokussieren Sie den Laserstrahl auf einen kleinen Teil der Probe – das konfokale Volumen –, um die Proteinmonomere anzuregen.

Die Proteinmoleküle diffundieren aufgrund der Brownschen Bewegung in das konfokale Volumen hinein und aus ihm heraus. Diese Bewegung führt zu schnellen Änderungen der Fluoreszenzintensität, was zu Schwankungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit führt.

Fügen Sie das Dimerisierungsmittel hinzu – einen bivalenten Liganden, der zwei Proteinmonomeren hilft, sich zu binden und somit ein Dimer zu bilden. Durch die Dimerisierung kommen zwei fluoreszierende Markierungen zu einem einzigen Partikel zusammen, wodurch die Fluoreszenzintensität pro Partikel – die molekulare Helligkeit – erhöht wird.

Die Zunahme der molekularen Helligkeit aufgrund der Dimerisierung erhöht die Amplitude der Fluoreszenzfluktuationen – da zwei fluoreszierende Markierungen gemeinsam in das konfokale Volumen eintreten und es verlassen.

Erhalten Sie Bilder des konfokalen Volumens im Laufe der Zeit vor und nach der Zugabe des Dimerisierungsmittels.

Berechnen Sie die Helligkeit der einzelnen Pixel in den konfokalen Bildern und erhalten Sie die mittlere Helligkeitskurve über die Zeit.

Die Zugabe des Dimerisierungsmittels führt zu einer zweifachen Erhöhung der Helligkeit aufgrund der dualen Fluoreszenzsignale jedes Partikels, während die Gesamtzahl der Proteinmoleküle gleich bleibt – was auf die Bildung von Dimeren hinweist.

Um das Multiwell-Plattenarray einzurichten, bereiten Sie zunächst eine Lösung aus 100 nanomolar gereinigtem FKBP12 in demselben Puffer vor, der auch für die Größenausschlusschromatographie verwendet wird. Beschallen und zentrifugieren Sie mit einer schnellen Umdrehung von 13.000 U/min, um die Bildung von Zuschlagstoffen zu verhindern.

Pipettieren Sie nun 100 bis 200 Mikroliter des verdünnten Proteins in eine 8-Well-Beobachtungskammer mit Glasboden. Geben Sie den BB-Dimerizer in Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 Nanomolar hinzu. Bereiten Sie als Referenz eine Lösung von 100 nanomolaren mVenus allein her, um potenzielle Aggregations- und Ausfällungseffekte zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit denselben Erfassungseinstellungen wiederherzustellen.

Jedes konfokale Licht-Scanning-Mikroskop-System, das mit digitalen Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren ausgestattet ist und in der Lage ist, eine konstante Verweilzeit für jedes erfasste Pixel zu halten, kann verwendet werden. Wählen Sie das Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur, das für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie entwickelt wurde.

Geben Sie nun einen Tropfen Wasser in das Wasserimmersionsobjektiv zur Halsbandkorrektur. Montieren Sie die 8-Well-Beobachtungskammer in die Bühne. Stellen Sie den Anregungsstrahlengang ein, indem Sie den 514-Nanometer-Laser einschalten und ihn am Ausgang des Objektivs auf 20 bis 100 Nanowatt Leistung einstellen. Schalten Sie einen HyD-Melder ein. Detektoren, die in der Lage sind, Photonen zu zählen, sind vorzuziehen. Wählen Sie das Emissionsfenster von 520 bis 560 Nanometern.

Verwenden Sie für den Aufnahmemodus eine Größe von 16 x 16 Pixeln.

Stellen Sie die Pixelverweilzeit so ein, dass die Framezeit länger ist als die Proteindiffusion und die Pixelverweilzeit viel kürzer ist. Dies entsprach einer Einstellung der Verweilzeit auf ca. 13 Mikrosekunden für das in dieser Demonstration verwendete System.

Stellen Sie die Lochblende auf eine Airy-Einheit ein, um die entsprechende Emission von ca. 545 Nanometern zu erreichen. Wählen Sie den XY-Zeit-Aufnahmemodus und wählen Sie die Anzahl der Frames aus, die pro Aufnahme und Well erfasst werden sollen. Stellen Sie nun die Pixelgröße auf ca. 120 Nanometer ein.

Wenn das System mit dem Hochdurchsatzmodus ausgestattet ist, geben Sie die Koordinaten jeder Vertiefung und die Anzahl der Erfassungen pro Vertiefung ein, um den Prozess zu automatisieren. Wenn das System mit einem Perfusionssystem ausgestattet ist, laden Sie die BB-Lösung und programmieren Sie die Perfusion so, dass sie direkt nach dem 5.000. Frame beginnt, um die Kinetik der Dimerisierung bei der Aufnahme von 10.000 Bildern zu bewerten.

Wählen Sie die richtige Vertiefung aus, und konzentrieren Sie sich auf die Lösung. Starten Sie dann die Erfassung und speichern Sie den resultierenden Bildstapel im TIFF-Format.