Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

Mit der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie kann der Oligomerisierungszustand von Proteinen in einer Probe bestimmt werden.

Nehmen Sie zunächst einen Objektträger mit Kammer, der eine fluoreszenzmarkierte Proteinmonomerlösung enthält. Legen Sie den Objektträger unter ein konfokales Mikroskop. Fokussieren Sie den Laserstrahl auf einen kleinen Teil der Probe – das konfokale Volumen –, um die Proteinmonomere anzuregen.

Die Proteinmoleküle diffundieren aufgrund der Brownschen Bewegung in das konfokale Volumen hinein und aus ihm heraus. Diese Bewegung führt zu schnellen Änderungen der Fluoreszenzintensität, was zu Schwankungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit führt.

Fügen Sie das Dimerisierungsmittel hinzu – einen bivalenten Liganden, der zwei Proteinmonomeren hilft, sich zu binden und somit ein Dimer zu bilden. Durch die Dimerisierung kommen zwei fluoreszierende Markierungen zu einem einzigen Partikel zusammen, wodurch die Fluoreszenzintensität pro Partikel – die molekulare Helligkeit – erhöht wird.

Die Zunahme der molekularen Helligkeit aufgrund der Dimerisierung erhöht die Amplitude der Fluoreszenzfluktuationen – da zwei fluoreszierende Markierungen gemeinsam in das konfo