Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

In seiner aktiven Form rekrutiert das Plasmamembran-assoziierte Ras-Monomer – ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein – Raf, eine inaktive Proteinkinase, die über ihre Ras-Bindungsdomäne an Ras bindet.

Diese Bindung führt zu einem funktionsfähigen Ras-Raf-Komplex, der den nachgeschalteten Signalprozess auslöst.

Um die intrazelluläre Ras-Raf-Interaktion zu visualisieren, beginnen Sie mit einer Suspension von gentechnisch veränderten Zellen in einem Objektträger mit guter Kammer. Diese Zellen exprimieren zwei nicht-fluoreszierende Fusionsproteine – eines besteht aus Ras, das über seinen N-Terminus mit der einen Hälfte eines photoaktivierbaren Fluorophors verbunden ist, und das andere besteht aus Raf, das an seinem C-Terminus mit der anderen Hälfte desselben Fluorophors fusioniert ist.

Im Inneren von Zellen docken Ras-haltige Fusionsproteine an die Plasmamembran an und interagieren mit Raf-haltigen Fusionsproteinen, wodurch die Fragmente des fluoreszierenden Proteins zu einem vollständigen photoaktivierbaren Fluorophor rekonstituiert werden. Das Fehlen von Ras- und Raf-Bindung hält die beiden Fluorophorhälften getrennt.

Füge dem Objektträger ein Fixierreagenz hinzu. Die fixierenden Mol