Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

In seiner aktiven Form rekrutiert das Plasmamembran-assoziierte Ras-Monomer – ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein – Raf, eine inaktive Proteinkinase, die über ihre Ras-Bindungsdomäne an Ras bindet.

Diese Bindung führt zu einem funktionsfähigen Ras-Raf-Komplex, der den nachgeschalteten Signalprozess auslöst.

Um die intrazelluläre Ras-Raf-Interaktion zu visualisieren, beginnen Sie mit einer Suspension von gentechnisch veränderten Zellen in einem Objektträger mit guter Kammer. Diese Zellen exprimieren zwei nicht-fluoreszierende Fusionsproteine – eines besteht aus Ras, das über seinen N-Terminus mit der einen Hälfte eines photoaktivierbaren Fluorophors verbunden ist, und das andere besteht aus Raf, das an seinem C-Terminus mit der anderen Hälfte desselben Fluorophors fusioniert ist.

Im Inneren von Zellen docken Ras-haltige Fusionsproteine an die Plasmamembran an und interagieren mit Raf-haltigen Fusionsproteinen, wodurch die Fragmente des fluoreszierenden Proteins zu einem vollständigen photoaktivierbaren Fluorophor rekonstituiert werden. Das Fehlen von Ras- und Raf-Bindung hält die beiden Fluorophorhälften getrennt.

Füge dem Objektträger ein Fixierreagenz hinzu. Die fixierenden Moleküle bilden Vernetzungen mit den Proteinen und stabilisieren die Proteinkomplexe.

Entfernen Sie das Fixierreagenz und fügen Sie einen Bildgebungspuffer hinzu. Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop-Set für photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie, PALM. Beleuchten Sie die Zellen mit einem hochintensiven Laser und aktivieren Sie eine kleine Untergruppe fluoreszierender Moleküle.

Stellen Sie die zufällig entstandene Fluoreszenz dar, die von jedem nanogroßen, einzelnen Fluorophor-markierten Ras-Raf-Komplex erzeugt wird, sichtbar als hochauflösende Fluoreszenzpunkte.

Um eine Probe für die Bildgebung vorzubereiten, werden etwa 5,5 x 10⁴ stabile Expressionszellen pro Vertiefung eines 8-Well-Objektträgers mit Glasboden in 350 Mikroliter phenolrotfreies DMEM getaucht. Verwenden Sie frisches Paraformaldehyd mit Glutaraldehyd, um die Zellen zu fixieren, und nachdem Sie das Fixiermittel durch PBS oder Bildgebungspuffer ersetzt haben, wirbeln Sie 100-Nanometer-Goldpartikel vor und fügen Sie 35 Mikroliter pro Vertiefung hinzu, um die Drift des Tisches während der Bildgebung zu verfolgen.

Nähern Sie sich dem Mikroskop und schalten Sie die 405- und 561-Nanometer-Laser ein. Halten Sie die Verschlüsse zu diesem Zeitpunkt geschlossen und stellen Sie sicher, dass der dichroitische 561-Nanometer-Spiegel und der Kerbfilter an Ort und Stelle sind. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware.

Schalten Sie die EMCCD-Kamera ein und lassen Sie sie abkühlen, und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden und die EMCCD-Verstärkung auf einen angemessenen Wert ein. Geben Sie Immersionsöl in das Objektiv und befestigen Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch. Bringen Sie dann die Probe entweder mit dem Hellfeld oder dem 561-Nanometer-Laser in den Fokus.

Verwenden Sie für die Abbildung von Ras und anderen Membranproteinen ein 60-faches Apochromat-TIRF-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,49 und bringen Sie das Mikroskop in TIRF-Konfiguration.

Stellen Sie den Anregungslaser so ein, dass er beim Auftreffen auf die hintere Öffnung des TIRF-Objektivs dezentriert ist, was dazu führt, dass der Laser beim Erreichen der Deckglaspufferschnittstelle abgelenkt wird. Passen Sie die Einfallsposition des Lasers so lange an, bis der kritische Winkel erreicht ist und der Laser zurückreflektiert wird.

Suchen Sie nach einer Zelle, die abgebildet werden soll und in der mehrere Goldpartikel angezeigt werden. Legen Sie dann einen Interessenbereich fest, der die Zelle oder einen Bereich davon und die Goldpartikel umschließt.

Falls aufgrund der hohen Expressionsniveaus bereits eine ausreichende Aktivierung erfolgt, beginnen Sie die Erfassung mit ausgeschaltetem 405-Nanometer-Laser und eingeschaltetem 561-Laser. Andernfalls schalten Sie den 405-Nanometer-Laser auf die niedrigste Werkseinstellung ein und erhöhen Sie sie allmählich, bis Dutzende von Molekülen pro Frame vorhanden sind oder die einzelnen Moleküle gut voneinander getrennt sind.

Erhöhen Sie im Laufe der Datenerfassung schrittweise die Laserleistung von 405 Nanometern, um die Punktdichte in etwa konstant zu halten. Setzen Sie die Bildaufnahme fort, bis eine hohe Leistung von 405 keine Aktivierungsereignisse mehr auslöst.