Fluoreszenzanisotropie zur Bestimmung der Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsaffinität

Der Transkriptionsfaktor TF ist ein Protein, das an die spezifische DNA-Region eines Gens bindet und die Transkription reguliert.

Um TF-DNA-Wechselwirkungen durch Fluoreszenzanisotropie zu messen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte. Geschmolzenes Gel, gemischt mit einer gepufferten Lösung, die bekannte Konzentrationen von Fluorophor-markierter Referenz-DNA enthält, die eine TF-Bindungsstelle und eine höhere Konzentration von TF-Molekülen umfasst, wird in die Vertiefung gegeben und inkubiert.

Da sich die markierte Referenz-DNA im Gel verteilt, stellt eine höhere TF-Molekülkonzentration sicher, dass alle DNA-Moleküle TF-gebunden sind. Fügen Sie eine gepufferte Lösung hinzu, die unmarkierte DNA von Mitbewerbern mit einer Einzelpunktmutation enthält.

Analysieren Sie das Gel der Platte mit Hilfe der Hochleistungs-Fluoreszenzanisotropiemikroskopie.

Polarisiertes Licht regt das DNA-gebundene Referenzfluorophor an, das sich aufgrund des molekularen Taumelns neu ausrichtet und multidirektionales depolarisiertes Licht emittiert – ein Phänomen, das als Fluoreszenzanisotropie (FA) bezeichnet wird.

Bei der Bindung an TF nimmt das Molekulargewicht des DNA-gebundenen Referenzfluorophors zu und es