SELEX-basierter In-vitro-Bindungsassay zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen

Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung, SELEX, ermöglicht die Identifizierung von proteinbindenden RNA-Sequenzen.

Zuerst erhalten Sie einen randomisierten RNA-Pool, der radioaktiv markierte RNAs mit randomisierten Sequenzen enthält, die sich zu hochspezifischen Strukturen falten. Inkubieren Sie mit dem Zielprotein. Das Protein bindet an RNA-Moleküle mit spezifischen Sequenzen und dreidimensionalen Strukturen, während unspezifische RNAs ungebunden bleiben.

Lassen Sie die Mischung durch einen Nitrozellulosefilter. Ungebundene RNA durchläuft die Filterporen, während RNA-Protein-Komplexe zurückgehalten bleiben.

Zerkleinern Sie den RNA-Protein-Komplex-haltigen Filter in Fragmente. Wiederholen Sie die RNA-Protein-Interaktion, indem Sie den RNA-Pool mit reduzierter Zielproteinkonzentration inkubieren – so ist nur die Bindung von Sequenzen mit hoher Affinität möglich, während Sequenzen mit niedriger Affinität nicht binden können.

Laden Sie diese Mischung auf ein Polyacrylamid-Gel und führen Sie eine Elektrophorese durch. Die RNA-Protein-Komplexe wandern im Vergleich zu ungebundenen RNAs mit geringer Affinität langsam durch das Gel. Die Röntgen-Gel-Bildgeb