SELEX-basierter In-vitro-Bindungsassay zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen

Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung, SELEX, ermöglicht die Identifizierung von proteinbindenden RNA-Sequenzen.

Zuerst erhalten Sie einen randomisierten RNA-Pool, der radioaktiv markierte RNAs mit randomisierten Sequenzen enthält, die sich zu hochspezifischen Strukturen falten. Inkubieren Sie mit dem Zielprotein. Das Protein bindet an RNA-Moleküle mit spezifischen Sequenzen und dreidimensionalen Strukturen, während unspezifische RNAs ungebunden bleiben.

Lassen Sie die Mischung durch einen Nitrozellulosefilter. Ungebundene RNA durchläuft die Filterporen, während RNA-Protein-Komplexe zurückgehalten bleiben.

Zerkleinern Sie den RNA-Protein-Komplex-haltigen Filter in Fragmente. Wiederholen Sie die RNA-Protein-Interaktion, indem Sie den RNA-Pool mit reduzierter Zielproteinkonzentration inkubieren – so ist nur die Bindung von Sequenzen mit hoher Affinität möglich, während Sequenzen mit niedriger Affinität nicht binden können.

Laden Sie diese Mischung auf ein Polyacrylamid-Gel und führen Sie eine Elektrophorese durch. Die RNA-Protein-Komplexe wandern im Vergleich zu ungebundenen RNAs mit geringer Affinität langsam durch das Gel. Die Röntgen-Gel-Bildgebung zeigt eine Bandenverschiebung, die der Position des RNA-Protein-Komplexes entspricht.

Schneiden Sie den komplexhaltigen Gelteil in Scheiben. Geben Sie Proteinase K zu den Filterfragmenten und Gelscheiben, verdauen Sie die Proteine und setzen Sie RNA aus dem Komplex frei. Fügen Sie Phenol-Chloroform und Zentrifuge hinzu, um die RNA von den verdauten Proteinen zu trennen.

Mischen Sie den RNA-haltigen Überstand mit Natriumacetat und Ethanol. Zentrifuge, um die RNA auszufällen. In RNase-freiem Wasser resuspendieren. Reverse-Transkribierung der RNA in komplementäre DNA und PCR-Amplifikation der DNA.

Wiederholen Sie mehrere Runden der filterbasierten und gelbasierten Trennung, um einen Pool von Zielprotein-spezifischen DNA-Sequenzen zu erhalten.

Um Protein und RNA in einem Reaktionsvolumen von 100 Mikrolitern zu binden, bereiten Sie zunächst 10 Millimolare Tris-Hydrochlorid bei einem pH-Wert von 7,5 her, das 50 Millimolare Kaliumchlorid, ein Millimolar DTT, 0,09 Mikrogramm pro Mikroliter Rinderserumalbumin, 0,5 Einheiten pro Mikroliter RNAsin, 0,15 Mikrogramm pro Mikroliter tRNA und 1 Millimolar EDTA enthält. Fügen Sie dann 30 Mikroliter rekombinantes Protein PTB und 10 Mikroliter RNA aus dem entsprechenden Pool hinzu.

Die Röhrchen mit den Bindungsreaktionen werden für etwa 30 Minuten bei 25 Grad Celsius in einen Temperaturblock gelegt. Als nächstes fraktionieren Sie die gebundene RNA von der ungebundenen RNA durch vier Selektions- und Amplifikationsrunden. Zuerst filtrieren Sie die 100-Mikroliter-Probe bei Raumtemperatur durch einen Nitrozellulosefilter, der an einem Vakuumverteiler befestigt ist. Der RNA-Protein-Komplex verbleibt auf dem Filter.

Schneiden Sie den Filter mit einer sterilen Rasierklinge in Stücke und geben Sie diese in ein Zentrifugenröhrchen. Tauchen Sie die Filterstücke in Proteinase-K-Puffer und legen Sie ihn für mindestens drei Stunden oder über Nacht auf einen Tumbler, um die RNA zurückzugewinnen.

Um die RNA-Probe zu deproteinisieren, fügen Sie ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform, Vortex, hinzu. Und dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Die wässrige Phase erhalten und wieder mit Chloroform extrahieren. Danach wird der Überstand mit 1/10 Volumen 3 molaren Natriumacetat bei pH 5,2 und zwei bis drei Volumen absolutem Ethanol gemischt.

Lassen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem -80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und zentrifugieren Sie es dann 10 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit. Wiederholen Sie die Wasch- und Trocknungsschritte mit 70 % Ethanol und lösen Sie die RNA in DEPC-behandeltem Wasser auf. Führen Sie nach der ersten Runde des Filterbindungsassays drei weitere Runden durch.

Führen Sie als Nächstes zwei Runden der Transkription, Bindung und Amplifikation durch, um die proteingebundenen RNA-Fraktionen von den ungebundenen Fraktionen zu trennen. Vorgegossen wird ein natives 5%iges Polyacrylamid-Gel mit einem Acrylamidbisacrylamid-Verhältnis von 60 zu 1 in 0,5x TBE-Puffer. Richten Sie dann die RNA-Protein-Bindungsreaktion ein.

Legen Sie das Gel in ein Elektrophoresegerät, das mit 0,5x FSME-Puffer gefüllt ist, in einem Kühlraum bei 4 Grad Celsius. Legen Sie 15 Minuten lang 250 Volt an und pipettieren Sie die Bindungsreaktion in verschiedene Vertiefungen. Fraktionieren Sie dann die gebundene RNA von der ungebundenen RNA, indem Sie die Elektrophorese ein bis zwei Stunden lang bei 250 Volt laufen lassen.

Setzen Sie anschließend das Gel einem Röntgenfilm aus und identifizieren Sie die Position der gebundenen RNA mittels Autoradiographie. Schneide die Gelscheibe mit der gebundenen RNA aus und führe sie in ein Röhrchen ein. Zerkleinern Sie die Gelscheibe und inkubieren Sie sie drei Stunden lang oder über Nacht im Proteinase-K-Puffer. Wiederholen Sie die Extraktion mit Phenol-Chloroform und Chloroform, wie zuvor beschrieben. Synthetisieren Sie cDNA aus der gelösten RNA.

Bereiten Sie 20 Mikroliter Reaktion vor, darunter zwei Mikroliter 10x RT-Puffer, zwei Mikroliter AMV-Reverse-Transkriptase, 1 Mikroliter Reverse-Primer, 5 Mikroliter Wasser und 10 Mikroliter der gelösten RNA. Inkubieren Sie bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten.

Amplifizieren Sie die cDNA mit 20 bis 25 PCR-Zyklen, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie den Prozess der RNA-Synthese, der Proteinbindung und der Trennung von proteingebundenen und ungebundenen Fraktionen.