Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

Ein chimäres onkogenes Fusionsprotein enthält die N-terminale Domäne mit geringer Komplexität, LCD, eines RNA-bindenden Proteins, das mit der DNA-Bindungsdomäne DBD eines Transkriptionsfaktorproteins fusioniert ist. Diese Proteine bilden ein Proteinkondensat, das die RNA-Polymerase-II rekrutiert und die Onkogenese antreibt.

Um die Assemblierung von Proteinkondensaten durch Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren, beginnen Sie mit einer DNA-Durchflusszelle – einem Objektträger aus Quarzglas, der mit Einlass- und Auslassinjektionsöffnungen ausgestattet ist. Die Oberfläche der Durchflusszelle ist zum Schutz der Oberfläche mit einer biotinylierten Lipiddoppelschicht beschichtet und mit einer Zickzack-Barriere versehen.

Verbinden Sie es mit einem mikrofluidischen System. Führen Sie eine Lösung von Streptavidin ein, die an seinen hochbindenden Liganden Biotin auf der Lipidschicht bindet. Injizieren Sie mit Biotin markierte doppelsträngige Lambda-DNA, die mehrere Wiederholungen von Fusionsprotein-Bindungssequenzen enthält. Das Streptavidin der Lipiddoppelschicht bindet an das Biotin der DNA und bindet die Lambda-DNA an die Doppelschicht.

Mit einem geeigneten Puffer spülen. Die hydrodyna