pH-Modulationsassay an gestützten Lipiddoppelschichten zum Nachweis von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat oder PIP2 ist ein geringfügig membrangebundenes phosphoryliertes Phospholipid. Phospholipase C oder PLC mit spezifischen PIP2-Bindungsdomänen bindet an PIP2 und erzeugt sekundäre Botenstoffe, die für mehrere zelluläre Prozesse unerlässlich sind.

Um PLC-PIP2-Wechselwirkungen in vitro nachzuweisen, beginnen Sie mit einem kleinen unilamellären Vesikel, SUV, saurer Suspension, bestehend aus PIP2 und Phospholipidgemisch, von denen eines an einen pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert ist.

Pipettieren Sie die Lösung in den Einlass- und Verbindungsauslassschlauch eines vormontierten mikrofluidischen Geräts. Übertragen und fixieren Sie das Gerät auf einem Fluoreszenzmikroskoptisch. Durch die Schwerkraft passieren SUVs den Mikrokanalboden, der aus einem hydrophilen Glasdeckglas besteht.

Die SUVs adsorbieren an der Glasoberfläche, wobei der pH-Wert der Lösung die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden reduziert. Die SUVs interagieren mit der Oberfläche, verformen sich und verschmelzen zu großen Vesikel.

Nach kritischer Oberflächenbedeckung reißen die Vesikel spontan auf und bilden eine gestützte Lipiddoppelschicht, SLB. Führen Sie einen Puffer durch den Kanal, wobei nicht adsorbierte Vesikel entfernt werden.

Mit einem geeigneten Fluoreszenzkanal wird der Mikrokanal abgebildet, um die pH-empfindliche Farbstofffluoreszenz – stark fluoreszierend bei niedrigem pH-Wert – im SLB zu visualisieren und zu messen.

Führen Sie eine rekombinante SPS-Lösung in den Mikrokanal ein. Der neutrale pH-Wert der Lösung, der unter dem isoelektrischen Punkt der SPS liegt, macht die SPS positiv geladen.

Die rekombinante PLC mit ihrer PIP2-Bindungsdomäne bindet an das PIP2 und rekrutiert negativ geladene Hydroxid-Ionen an die Doppelschichtoberfläche. Dadurch wird die Doppelschichtoberfläche basischer, wodurch sich der Protonierungszustand des Farbstoffs verschiebt und eine Fluoreszenzlöschung verursacht wird, was auf PLC-PIP2-Wechselwirkungen hinweist.

100 Mikroliter des Phosphatidyl-Inositol-4-5-bisphosphats, das kleine unilamelläre Vesikel enthält, in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf etwa 3,2 ein, indem Sie 6,4 Mikroliter 0,2 normale Salzsäure hinzufügen.

Pipettieren Sie 10 Mikroliter der pH-eingestellten kleinen unilamellären Vesikellösung durch den Einlass in jeden Kanal und üben Sie mit der Pipette Druck aus, bis die Lösung den Auslass erreicht. Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie am Gerät befestigt. Nachdem Sie diesen Schritt für jeden Kanal wiederholt haben, inkubieren Sie das Gerät 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Die Injektion von Vesikeln in Mikrokanäle sollte unmittelbar nach der Montage des Geräts erfolgen. Schneiden Sie in der Zwischenzeit Sätze von Einlass- und Auslassschläuchen ab. Verbinden Sie den Auslassschlauch mit einer Pinzette mit dem Gerät und kleben Sie das Gerät dann auf einen Mikroskoptisch.

Tauchen Sie ein Ende des Einlassschlauchs in 25 Milliliter Laufpuffer, der in einem konischen Schlauch enthalten ist, und kleben Sie ihn ab, um sicherzustellen, dass der Schlauch gesichert ist. Platzieren Sie das konische Röhrchen mit einem Laborheber auf einem höheren Boden als das Gerät, um die Lösung durch die Schwerkraft durch die Mikrokanäle zu drücken.

Verwenden Sie für jeden Einlassschlauch eine Spritze, um 1 Milliliter Laufpuffer aus dem freien Ende des Schlauchs zu ziehen. Entfernen Sie die Pipettenspitze vom Einlass und führen Sie das freie Ende des Einlassschlauchs in das Gerät ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle Einlassschlauchstücke mit dem Gerät zu verbinden. Fließender Laufpuffer durch die Kanäle hilft, überschüssige, nicht gerissene Vesikel zu entfernen und die Doppelschicht auf experimentelle Bedingungen auszugleichen.

Öffnen Sie anschließend die Mikroskopsteuerungssoftware. Klicken Sie im linken Bereich auf die Registerkarte "Mikroskop" und wählen Sie das Objektiv "10x". Klicken Sie auf "Live" und dann auf die "Alexa 568"-Bildsymbole in der Symbolleiste. Fokussieren Sie sich mit den Einstellknöpfen "Fein" und "Grob" auf die Mikrokanäle. Scannen Sie das Gerät, um die Qualität der SLBs und der Kanäle zu überprüfen.

Klicken Sie dann auf das Bildsymbol "FL Shutter Closed" in der Symbolleiste. Klicken Sie auf die Registerkarte "Aufnahme" und wählen Sie unter "Grundlegende Anpassungen" die Belichtungszeit aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 Millisekunden ein. Klicken Sie im linken Bereich auf "Mehrdimensionale Erfassung". Wählen Sie im Menü "Filter" den roten Kanal aus. Klicken Sie dann auf das Menü "Zeitraffer". Legen Sie das Zeitintervall auf 5 Minuten, die Dauer auf 30 Minuten und das Zeitraffermenü fest.

Wählen Sie das Werkzeug "Kreis" unter der Registerkarte "Messen" und zeichnen Sie einen Kreis in einem beliebigen Kanal. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während der Kreis ausgewählt ist, und wählen Sie "Eigenschaften". Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Profil" die Option "Alle T", um die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass diese Kurve ein Plateau erreicht, das auf ein Gleichgewicht hinweist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Senken Sie die Pufferlösung auf die gleiche Masse wie die Vorrichtung ab, um den Durchfluss zu stoppen. Lösen Sie nacheinander jeden Auslassschlauch und geben Sie mit einer Pipette 200 Mikroliter jeder Proteinverdünnung in den Auslasskanal. Üben Sie keinen Druck aus. Lassen Sie die Schwerkraft die Arbeit machen. Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an der mikrofluidischen Vorrichtung befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal und stellen Sie sicher, dass während dieses Vorgangs keine Luftblasen in die Kanäle gelangen.

Senken Sie als Nächstes den Einlassschlauch auf einen Boden unterhalb des mikrofluidischen Geräts ab, um das Protein durch die Mikrokanäle zu fließen. Klebe das freie Ende des Schlauchs an einen Abfallbehälter. Lassen Sie die Verdünnungen der Pleckstrin Homologiedomäne 30 Minuten lang fließen. Klicken Sie im linken Bereich der Software auf der Registerkarte "Zeitraffer" auf "Start", um das Imaging erneut zu starten.