Dynamische Differenzkalorimetrie zur Untersuchung der Interaktion zwischen DNA-Aptamer und thermolabilen Liganden

Die dynamische Differenzkalorimetrie hilft bei der Untersuchung von Biomolekül-Liganden-Wechselwirkungen, indem sie die Wärme misst, die erforderlich ist, um das Biomolekül in Abwesenheit und Anwesenheit des Liganden zu denaturieren.

Nehmen Sie zunächst eine Referenz mit freien DNA-Aptameren – strukturierten einzelsträngigen Oligonukleotiden – und eine Probe mit thermolabilen ligandengebundenen Aptameren. Die Liganden stabilisieren die Sekundärstruktur des Aptamers.

Führen Sie einen Vorwärtsscan durch, indem Sie die Lösungen erhitzen. Bei Erreichen der Schmelztemperatur denaturieren die freien Aptamere.

Die ligandenstabilisierten Aptamere dissoziieren von den Liganden und denaturieren bei einer relativ höheren Temperatur, was zu einer Erhöhung der Schmelztemperatur im Vergleich zu den freien Aptameren führt. Bei hohen Temperaturen erhält eine Untergruppe von Liganden eine irreversible Sekundärform mit geringer Bindungsaffinität.

Führen Sie anschließend einen Rückwärtsscan durch, indem Sie die Lösungen abkühlen, um die Aptamerstruktur wiederherzustellen. Bei der niedrigeren Temperatur binden der anfängliche und der umgesetzte Ligand in der Probe an die Aptamere.

Während des zweiten Vorwärtsscans dissoziieren und denaturieren die Aptamere, die mit einer schwachen Affinität zu den umgewandelten Liganden gebunden sind, bei einer niedrigeren Temperatur als die ursprünglichen ligandengebundenen Aptamere, was zu einer Verschiebung der Schmelztemperatur führt.

Bei aufeinanderfolgenden Scans setzen sich die Liganden weiter in die sekundäre Form um, was zu einer vollständigen Erschöpfung der ursprünglichen Form führt. Besorgen Sie sich das Thermogramm.

Mit jedem Scan verschiebt sich die Schmelztemperatur des ligandengebundenen Aptamers in Richtung des freien Aptamers, was auf die schwache Bindungsaffinität der Sekundärform hinweist.

Entgasen Sie den Puffer, das Biomolekül und die Ligandenlösungen in einem Tischentgaser, bevor Sie sie in das dynamische Differenzkalorimeter (DSC) laden. Schrauben Sie den Druckgriff vom DSC ab. Führen Sie dann einen Silikonschlauch aus dem Arbeitspuffer und befestigen Sie ihn am vorderen Flansch der Referenzkapillare.

Erstellen Sie eine Brücke zwischen der Referenz- und der Probenkapillare, indem Sie den hinteren Referenzflansch mit dem vorderen Probenflansch verbinden. Befestigen Sie als Nächstes ein Stück Silikonschlauch am hinteren Probenflansch, der zu einem Abfallkolben führt, an dem eine Vakuumleitung angeschlossen ist. Schalten Sie die Vakuumleitung ein, um den DSC mit 200 Millilitern Arbeitspuffer zu spülen.

Beginnen Sie damit, etwa 3 bis 5 Zentimeter große Abschnitte des Silikonschlauchs an den Referenzkapillarflanschen zu befestigen. Führen Sie als Nächstes eine 1-Milliliter-Pipettenspitze in den Silikonschlauch des hinteren Flansches ein. Ziehen Sie mit einer Pipette 0,8 Milliliter Arbeitspuffer und führen Sie die Pipettenspitze mit Puffer in den Silikonschlauch des vorderen Referenzflansches ein.

Drücken Sie den Pipettenkolben vorsichtig nach unten, um den Arbeitspuffer durch den vorderen Silikonschlauch in die Referenzkapillare und nach oben in die angebrachte Pipettenspitze des hinteren Flansches zu führen. Drücken Sie den Pipettenkolben nach unten, bis der Arbeitspuffer knapp über dem vorderen Silikonschlauch liegt. Lassen Sie dann den Pipettenkolben los, bis der Arbeitspuffer knapp über dem hinteren Silikonschlauch liegt. Führen Sie den Arbeitspuffer in der Referenzkapillare weiter hin und her, um das Volumen von Blasen zu reinigen.

Verschließen Sie dann die hintere Pipettenspitze mit einem Zeigefinger und ziehen Sie sie vorsichtig an der hinteren Pipettenspitze und der vorderen Pipette nach oben, um sie mit dem angebrachten Silikonschlauch aus den Referenzflanschen zu entfernen. Laden Sie die Probenkapillare wie zuvor mit Arbeitspuffer.

Setzen Sie eine schwarze Kunststoffkappe auf die hinteren Referenz- und Probenflansche, so dass die vorderen Flansche nicht abgedeckt sind. Befestigen Sie den Druckgriff an der DSC und öffnen Sie dann die DSC-Software und setzen Sie das Gerät unter Druck, indem Sie auf den roten Pfeil "Nach oben" oben auf der Benutzeroberfläche klicken, sobald sich der Leistungsmesswert stabilisiert hat. Die DSC-Leistung wird in einem Feld oben rechts auf der Benutzeroberfläche zusammen mit der Temperatur- und Druckanzeige des Geräts angezeigt.

Äquilibrieren Sie den DSC mit dem Arbeitspuffer, indem Sie einen Vorwärts- und Rückwärtsscan durchführen. Stellen Sie sicher, dass auf der Registerkarte "Experimentelle Methode" auf der linken Seite des Bildschirms die Option "Scannen" ausgewählt ist, um den DSC im Temperaturscanmodus auszuführen.

Klicken Sie im Einschub "Temperaturparameter" unter dem Reiter "Experimentelle Methode" auf die Schaltfläche zum Heizen. Geben Sie 1 und 100 Grad Celsius für die untere und obere Versuchstemperatur, 1 Grad Celsius pro Minute für die Abtastrate und 60 Sekunden für die Äquilibrierungsperiode ein. Klicken Sie auf den Button "Serie hinzufügen" unter dem Eingabefeld für den Ausgleichszeitraum. Geben Sie 2 in das Feld "Schritte zum Hinzufügen" im Popup-Fenster ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Alternative Heizung/Kühlung". Klicken Sie auf "OK".

Die hinzugefügten Scans werden im unteren Teil der Benutzeroberfläche angezeigt. Überprüfen Sie, ob die Parameter für jeden Scan wie gewünscht sind. Starten Sie das Experiment, indem Sie auf die grüne Schaltfläche "Play" oben auf der Benutzeroberfläche klicken. Navigieren Sie zum gewünschten Fenster, und geben Sie im Popup-Fenster einen Dateinamen zum Speichern des Experiments ein. Zeigen Sie den Fortschritt des Experiments an, indem Sie auf die Registerkarte "Daten" rechts neben der Registerkarte "Experimentmethode" klicken.

Führen Sie Referenzexperimente für die Basisliniensubtraktion der Probendaten durch, indem Sie den DSC mit Arbeitspuffer in beiden Kapillaren neu laden. Sammeln Sie mehrere Vorwärts- und Rückwärtsscans über einen geeigneten Temperaturbereich bei 1 Grad Celsius pro Minute mit einer oberen Äquilibrierungszeit von 120 Sekunden.

Löschen Sie die vorherigen Puffer-Äquilibrierungsscans aus dem unteren Teil der Schnittstelle, indem Sie jeden einzelnen markieren und auf das rote "X" in der Mitte rechts auf der Benutzeroberfläche klicken.

Fügen Sie die neuen Scans hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche "Serie hinzufügen" klicken, die Zahl 20 in das Feld für "Hinzuzufügende Schritte " eingeben und das Kontrollkästchen "Alternatives Heizen/Kühlen" aktivieren. Klicken Sie dann auf "OK" und führen Sie das Experiment aus, indem Sie wie zuvor auf die grüne Schaltfläche "Abspielen" klicken.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einem Arbeitspuffer, der die gewünschte Konzentration des Liganden in beiden Kapillaren enthält, um die Referenzexperimente für den Liganden zu erhalten. Sammeln Sie zwei separate Experimente, die zur Ermittlung der Geschwindigkeitskonstante für die thermolabile Ligandenumwandlung verwendet werden.

Für den Datensatz der freien Biomoleküle wurde sichergestellt, dass die Referenzkapillare den Arbeitspuffer enthält, während die Probenkapillare das freie Biomolekül in der gewünschten Konzentration im Arbeitspuffer enthält. Führen Sie anschließend die Beispielexperimente mit dem gleichen DSC-Ladeverfahren und den gleichen experimentellen Parametern durch, die in den Referenzscans verwendet werden.

Stellen Sie bei den ligandengebundenen Experimenten sicher, dass sich der Ligand im Arbeitspuffer in der Referenzkapillare und das Biomolekül plus Ligand im Arbeitspuffer in der Probenkapillare befindet. Spülen Sie das System zwischen den Zusätzen verschiedener Liganden wie zuvor.

Führen Sie ein zusätzliches Experiment mit dem Biomolekül durch, das an den thermolabilen Liganden gebunden ist, bei dem die Hochtemperatur-Gleichgewichtsperiode auf 600 Sekunden erhöht wird und alle anderen experimentellen Parameter die gleichen sind wie zuvor. Fahren Sie mit der Datenverarbeitung und -analyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.