Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Die Wechselwirkung zwischen einem T-Zell-Rezeptor, TCR, und einem antigenen Peptid, das vom MHC oder Haupthistokompatibilitätskomplex auf einer Antigen-präsentierenden Zelle, APC, präsentiert wird, bewirkt, dass die T-Zelle eine mechanische Kraft auf den APC ausübt. Dieses Phänomen ist für die Aktivierung der T-Zellen notwendig.

Um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit einer Biomembran-Kraftsonde (BFP) zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer objektträgerbasierten benutzerdefinierten Zellkammer. Legen Sie die Zellkammer unter ein Mikroskop.

Injizieren Sie Suspensionen von biotinylierten gequollenen Erythrozyten, sondieren Sie Glasperlen, die mit peptidgebundenen MHC-Streptavidin-Biotin-Komplexen beschichtet sind, und T-Zellen in die Kammer. Positionieren Sie die Sonde, das Ziel und die mit Pufferpuffern gefüllten Mikropipetten um die Kammer herum.

Aspirieren Sie mit der Sondenpipette eine biotinylierte Erythrozytenfrequenz und positionieren Sie sie in einem leeren Bereich. Aspirieren Sie eine T-Zelle mit der Ziel-Mikropipette und positionieren Sie sie auf der rechten Seite der Erythrozyten. Aspirieren Sie eine Sondenperle mit der Hilfsmikropipette und befestigen Sie sie an der Spitze der Erythrozyten. Das Streptavidin der Kugel bindet an das Biotin der Erythrozyten und bildet eine Kraftsonde.

Richten Sie die T-Zelle mit der Kraftsonde aus, damit der TCR mit seinem Liganden – dem MHC-gebundenen Peptid – interagieren und die T-Zelle Kraft auf die Erythrozyten ausüben kann. Ziehen Sie die T-Zelle zurück, um die TCR-Peptidbindung zu brechen, die die Erythrozyten verformt und die Perle verdrängt.

Messen Sie die Kraft, die erforderlich ist, um die Bindung zu brechen – eine stärkere Verbindung benötigt eine höhere Kraft und mehr Zeit, um zu brechen, was auf eine längere Lebensdauer hinweist.

Um das BFP-Experiment zu starten, schalten Sie das Mikroskop und die Lichtquelle ein. Stellen Sie die Kammer auf den Hauptmikroskoptisch. Der nächste Schritt besteht darin, alle drei Mikropipetten des BFP zu installieren. Die Sonde auf der linken Seite dient zum Greifen einer RBC. Das Ziel auf der rechten Seite ist es, die Zelle zu greifen, und der Helfer unten rechts dient dazu, eine Perle zu greifen.

Verwenden Sie zur Installation einen Mikroinjektor, um eine Mikropipette mit experimentellem Puffer zu verfüllen. Nehmen Sie die Mikropipette vom Pipettenhalter und halten Sie sie an einer niedrigeren Stelle, damit die Flüssigkeit aus der Spitze tropfen kann. Führen Sie die Mikropipette schnell in die Halterspitze ein und achten Sie darauf, dass während des Einführens keine Luftmikroblase in die Mikropipette gelangt.

Ziehen Sie die Halterschraube fest und montieren Sie dann jeden Pipettenhalter auf den entsprechenden Mikromanipulator. Schieben Sie die Mikropipette in Richtung der Kammer, so dass ihre Spitzen in den Pufferbereich der Kammer gelangen. Passen Sie die Position der Mikropipette an und suchen Sie sie unter dem Sichtfeld des Mikroskops.

Bewege dich auf der Bühne des Kammerhalters, um die Kolonien der drei Elemente nacheinander zu finden. Stellen Sie die Position der entsprechenden Mikropipette ein, indem Sie die Knöpfe der Manipulatoren so drehen, dass sich die Spitze der Mikropipette einer Zelle oder Perle nähert. Aspirieren Sie die Zelle oder den Kügelchen, indem Sie den Druck in der entsprechenden Mikropipette einstellen. Alle drei Mikropipetten erfassen die entsprechenden Elemente.

Bewegen Sie sich um die Kammerhalterbühne herum, um einen offenen Raum abseits der Kolonien der injizierten Elemente zu finden, in dem das Experiment durchgeführt wird.

Schalten Sie den visuellen Modus des Mikroskops um, um das Bild im Computerprogramm zu visualisieren. Bewegen Sie alle drei Elemente auf den Pipettenspitzen in das Sichtfeld des Programms. Richten Sie als Nächstes die Sondenperle und die Erythrozytenleiste aus und manövrieren Sie die Sondenraupe vorsichtig zur Spitze der Erythrox. Stoßen Sie nun kurz auf die Erythrozyten und ziehen Sie sie vorsichtig zurück.

Passen Sie den Druck der Hilfsmikropipette so an, dass die Perle vorsichtig weggeblasen wird, so dass sie auf der RBC-Spitze kleben bleibt. Bewegen Sie die Mikropipette weg, richten Sie das Ziel und die Sondenperle aus.

Verwenden Sie im Programm im Fenster "Sichtfeld" die Programmwerkzeuge, um die jeweiligen Radien der Sondenmikropipette, der Erythrozyten und der kreisförmigen Kontaktfläche zwischen der Erythrampe und der Sondenraupe zu messen. Diese Werte ermöglichen die Abschätzung der Federkonstante des RBC anhand der im Textprotokoll aufgeführten Gleichung

Nachdem Sie die gewünschte RBC-Federkonstante in das Programm eingegeben haben, zeichnen Sie eine horizontale Linie über den RBC-Scheitelpunkt, die im angrenzenden Fenster eine Kurve ergibt, die die Helligkeit jedes Pixels entlang dieser Linie anzeigt. Ziehen Sie die Schwellenwertlinie so, dass sie etwa halb so tief wie die Kurve ist.

Wählen Sie anschließend den gewünschten Experimentmodus aus. Stellen Sie die Parameter wie gewünscht ein. Klicken Sie auf Start, wodurch das Programm die Zielpipette bewegen und das Ziel in den Kontakt mit der Sonde und wieder heraus fahren kann.

Die Datenerfassung erfolgt parallel, wobei die Position der Sondenraupe in Echtzeit aufgezeichnet wird. Stoppen Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Experiment stoppen klicken, woraufhin ein Fenster erscheint, in dem Sie die erfassten Daten speichern können.