Viraler Antigen-Microarray-Assay zum Nachweis von Antikörper-Isotypen im Serum gegen virales Antigen

Beginnen Sie den viralen Antigen-Microarray-Assay mit einem vorbereiteten viralen Antigen-Microarray-Objektträger.

Der Objektträger enthält mehrere Pads, jedes mit einem einzigen Array mit Hunderten von gereinigten Antigenen mehrerer Virusstämme, die auf Spots gedruckt sind, die in einem Raster angeordnet sind. Jeder Spot enthält einen einzelnen Antigentyp, der an der dreidimensionalen mikroporösen Nitrozelluloseoberfläche adsorbiert ist.

Befestigen Sie den Objektträger in einer Kammer, um die Handhabung bei nachfolgenden Schritten zu erleichtern. Fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, der Proteine enthält, die an die verbleibenden Oberflächen des Objektträgers binden, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an die Oberfläche zu verhindern.

Inkubieren Sie den Microarray-Objektträger mit verdünntem humanem Serum. Die Antikörper-Isotypen im Serum, die spezifisch für die Antigene auf dem Objektträger sind, erkennen und binden an die Epitope der Antigene.

Entfernen Sie das Serum. Mit einem Puffer waschen, um ungebundene Antikörper und Proteine auf dem Objektträger zu entfernen.

Fügen Sie Quantenpunkt-konjugierte Sekundärantikörpermischungen hinzu, die jeweils einen anderen Quantenpunkt enthalten. Die isotypspezifischen Sekundärantikörper binden spezifisch an den jeweiligen Serum-Antikörper-Isotyp, der an die Antigene auf dem Objektträger gebunden ist.

Verwenden Sie einen Microarray-Imager, um die Antikörperbindung an Antigene innerhalb des Microarray-Objektträgers zu quantifizieren.

Nach Anregung bei geeigneten Wellenlängen kehren die an Sekundärantikörper gebundenen Quantenpunkte in den Grundzustand zurück und senden spezifische Fluoreszenzsignale aus, die vom Photodetektor detektiert werden.

Die Spot-Fluoreszenzintensität quantifiziert den Serum-Antikörper-Isotyp innerhalb des Serums, das an das individuelle Antigen gebunden ist.

Nachdem Sie die Drucksoftware mit dem gewünschten Protokoll programmiert haben, starten Sie den Drucklauf. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die ungeprüften Microarray-Objektträger in einer lichtdichten Box in einem Exsikkatorschrank bei Raumtemperatur.

Um Seren auf dem Microarray auf Antikörper zu untersuchen, verwenden Sie Clips, um die Microarray-Objektträger mit der Pad-Seite nach oben an den Sondierungskammern zu befestigen, und platzieren Sie die Kammern in den Rahmen.

Seien Sie vorsichtig beim Zusammenbau der Objektträger, da sie leicht zu brechen sind, und prüfen Sie nach der Rehydrierung auf Undichtigkeiten. Falls erforderlich, zerlegen Sie die Schienen und bauen Sie sie wieder zusammen, um Undichtigkeiten zu beheben.

Rehydrieren Sie die Objektträger mit 100 Mikrolitern gefiltertem Blockierungspuffer pro Vertiefung und verdünnen Sie die Seren im Verhältnis 1 zu 100 in 100 Mikrolitern Blockierungspuffer pro Probe. Inkubieren Sie dann die rehydrierten Microarray-Objektträger und die verdünnten Seren 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und 100 bis 250 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler.

Am Ende der Inkubation verwenden Sie Pipettenspitzen, die an eine Vakuumleitung mit einem sekundären Auffangkolben angeschlossen sind, um den Blockierungspuffer vorsichtig aus der Ecke jeder Kammer abzusaugen, ohne die Pads zu berühren, und geben Sie die verdünnten Seren sofort auf die Pads, ohne die Pads trocknen zu lassen. Legen Sie dann die abgedeckten Rahmen in Tabletts mit feuchten Papiertüchern, die versiegelt sind, um die Feuchtigkeit zu erhalten, und inkubieren Sie die Rahmen über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Schaukelschüttel.

Für die Markierung von Quantenpunkt-konjugierten Sekundärantikörpern aspirieren Sie die Seren vorsichtig, wie gerade gezeigt, und spülen Sie die Objektträger mit drei Wäschen in 100 Mikrolitern frischem T-TBS-Puffer pro Vertiefung für jeweils 5 Minuten auf einem Orbitalschüttler. Die Objektträger werden dann mit einer Mischung aus Quantenpunkt-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert und dann dreimal gewaschen, wie im Protokoll beschrieben, wobei die gleiche Technik wie gerade gezeigt

Entfernen Sie nach dem letzten Waschen vorsichtig die Objektträger aus den Kammern, spülen Sie die Objektträger vorsichtig mit gefiltertem, doppelt destilliertem Wasser ab und legen Sie dann jeden Objektträger in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Trocknen Sie dann die Objektträger durch Zentrifugieren.

Um Bilder der Microarray-Objektträger aufzunehmen, schalten Sie zuerst den tragbaren Imager ein und legen Sie den zu bebildernden Objektträger vorsichtig mit der Vorderseite nach unten in den Objektträgerhalter in der Bildgebungskammer. Öffnen Sie die Imaging-Software und wählen Sie auf der Registerkarte "Imager konfigurieren" die entsprechende Folienkonfiguration aus.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Bildsteuerung" den entsprechenden Fluoreszenzkanal aus und passen Sie die Belichtungs- und Aufnahmezeiten je nach Reaktivität der Seren an. Klicken Sie dann auf "Aufnehmen", um die Bildaufnahme zu starten. Verwenden Sie am Ende der Erfassung die Gitter, die an den Passermarken ausgerichtet sind, um die Array-Spots zu erkennen.