TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Aktinmonomere polymerisieren von Kopf bis Ende zu dünnen Fasern, die als Mikrofilamente bezeichnet werden. In ähnlicher Weise polymerisieren Tubulin-Dimere zu längeren hohlen zylindrischen Mikrotubuli. Diese Zytoskelettkomponenten erhalten die Zellform und erleichtern die Zellmotilität.

Um die Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli durch Totalreflexionsmikroskopie (TIRF) zu visualisieren, wird eine kundenspezifische Bildgebungsanordnung verwendet.

Die Bildgebungseinheit besteht aus zwei Deckgläsern: einem oberen m-PEG-silanbeschichteten Deckglas und einem unteren biotin-PEG-silanbeschichteten Deckglas. Die beiden Deckgläser sind mit doppelseitigem Klebeband in Längsrichtung angeordnet und an beiden Enden zu einem Strömungskanal versiegelt.

Pipettieren Sie BSA in den Strömungskanal, um die Kammer zu entlüften. Fügen Sie Streptavidin-Lösung hinzu und inkubieren Sie. Die Streptavidin-Moleküle binden an die Biotin-Moleküle, die an das PEG-Silan des unteren Deckglases gebunden sind.

Lassen Sie den TIRF-Puffer in den Kanal fließen. Fügen Sie eine Zytoskelett-Mischlösung hinzu, die unmarkierte und grüne Fluorophor-markierte Tubulin-Dimere zusammen mit unmarkierten, Biotin-markierten und violett fluorophor-markierten Aktin-Monomeren enthält.

Als nächstes fügen Sie eine Reaktionslösung hinzu, die ATP – Aktin-Polymerisationsfördermittel – und GTP – Tubulin-Polymerisationsfördermittel und Aktin-Mikrotubuli-Kupplungsprotein enthält. Ausbrüten.

Die Tubulin-Dimere binden an die GTP-Moleküle und polymerisieren, während die Aktin-Monomere an die ATP-Moleküle binden und polymerisieren, um Mikrotubuli bzw. Mikrofilamente zu bilden.

Stellen Sie die Bildgebungseinheit unter ein TIRF-Mikroskop. Stimulieren Sie die Fluorophore mit Lasern geeigneter Wellenlängen.

Das Anregungslicht reflektiert intern und erzeugt ein Lichtfeld, das die Fluorophore selektiv in einem begrenzten Bereich in der Nähe der Glas-Wasser-Grenzfläche beleuchtet, wo es zwei Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gibt. In diesem Bereich erscheinen die Mikrofilamente violett und die Mikrotubuli grün.

Schneiden Sie 12 Streifen doppelseitiges, doppelseitiges Klebeband auf eine Länge von 24 Millimetern ab. Entfernen Sie eine Seite der Bandunterlage und befestigen Sie die Klebebandstücke neben den sechs Rillen in einer sauberen Bildgebungskammer. Entfernen Sie das zweite Stück Klebebandträger, um die klebrige Seite des Klebebandes entlang jeder Kammerrille freizulegen, und legen Sie die Kammer mit der Klebebandseite nach oben auf eine saubere Oberfläche.

Mischen Sie Epoxidharz- und Härterlösungen eins zu eins in einem kleinen Wiegeschiffchen und platzieren Sie mit einer P1000-Spitze einen Tropfen gemischtes Epoxidharz zwischen den Klebebandstreifen am Ende jeder Bildgebungskammernut. Legen Sie dann das Kammerband oder die Epoxidseite nach oben auf eine saubere Oberfläche.

Nehmen Sie ein beschichtetes Deckglas aus dem 70 Grad Celsius heißen Inkubator und spülen Sie die beschichteten und unbeschichteten Oberflächen der Deckgläser sechsmal mit doppelt destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie es mit gefiltertem Stickstoffgas und kleben Sie es dann mit der Deckglasbeschichtung in die Bildgebungskammer, wobei die Deckglasbeschichtung mit der Seite zum Band zeigt.

Verwenden Sie eine P200- oder P1000-Pipettenspitze, um Druck auf die Band-Glas-Schnittstelle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen dem Band und dem Deckglas zu gewährleisten. Inkubieren Sie die zusammengebauten Kammern mindestens fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit das Epoxidharz die Kammerwände vor der Verwendung vollständig abdichten kann.

Perfusionskammern verfallen innerhalb von 12 bis 18 Stunden nach dem Zusammenbau. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe und tauschen Sie nacheinander Konditionierungslösungen in der Perfusionskammer aus, indem Sie 50 Mikroliter 1 % BSA zur Grundierung der Bildgebungskammer fließen lassen.

Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Luer-Lock-Anschlussbehälter. Lassen Sie dann 50 Mikroliter 0,005 Milligramm Streptavidin pro Milliliter fließen und inkubieren Sie ein bis zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Behälter.

50 Mikroliter 1 % BSA fließen lassen, um die unspezifische Bindung zu blockieren, und 10 bis 30 Sekunden lang inkubieren. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Behälter. Als nächstes fließen 50 Mikroliter warmer 1x TIRF-Puffer und dann 50 Mikroliter stabilisierte und 50% biotinylierte Mikrotubuli-Samen, verdünnt in 1x TIRF-Puffer.

Stellen Sie das Heizgerät auf dem Tisch oder Objektiv so ein, dass es 30 Minuten lang eine Temperatur von 35 bis 37 Grad Celsius aufrechterhält, bevor die erste biochemische Reaktion abgebildet wird. Stellen Sie dann das Erfassungsintervall auf alle fünf Sekunden für 15 bis 20 Minuten ein. Stellen Sie als Nächstes die 488- und 647-Laser-Belichtungen auf 50 bis 100 Millisekunden bei 5 % bis 10 % Leistung ein, indem Sie zuerst die Polymerisationsreaktion anpassen, um die Aktinfilament-Assemblierung zu initiieren.

Nehmen Sie die Bilder bei 647 Nanometern auf und nehmen Sie die entsprechenden Anpassungen vor. Passen Sie dann die Polymerisationsreaktion in einer zweiten konditionierten Perfusionsvertiefung an, um die Mikrotubuli-Assemblierung zu initiieren. Visualisieren Sie bei 488 Nanometern und nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor.

Kombinieren Sie drei Mikroliter 10-mikromolares 488-Tubulin mit dem 7,2-Mikroliter-Aliquot von 100 mikromolar fluoreszierendem unmarkiertem Tubulin, nicht länger als 15 Minuten vor der Anwendung. Kombinieren Sie dann drei Mikroliter verdünntes biotinyliertes Aktin in geeigneten Volumina von fluoreszierendem unmarkiertem und markiertem Aktin, so dass die endgültige Mischung 12,5 mikromolares Gesamtaktin mit 10 % bis 30 % fluoreszierender Markierung beträgt.

Bereiten Sie den Zytoskelett-Mix vor, indem Sie zwei Mikroliter des 12,5-mikromolaren Aktin-Mix-Mixes mit dem Tubulin-Stock-Mix kombinieren, nicht mehr als 15 Minuten vor der Bildgebung. Bis zur Verwendung auf Eis lagern.

Bereiten Sie die Proteinreaktionsmischung vor, indem Sie alle anderen experimentellen Komponenten und Proteine kombinieren, einschließlich 2x TIRF-Puffer, Antibleichmittel, Nukleotide, Puffer und akzessorische Proteine. Inkubieren Sie die Zytoskelettmischung separat in der Proteinreaktionsmischung bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Sekunden.

Um die Reaktion zu starten, fügen Sie den Inhalt des Proteinreaktionsgemisches zum Zytoskelett-Mix hinzu und mischen Sie es. 50 Mikroliter des Reaktionsmixes, der 1x TIRF-Puffer enthält, ergänzt mit 15 mikromolaren freien Tubulin, einem millimolaren GTP, 0,5 mikromolaren Aktinmonomeren und geeigneten Volumina von Pufferkontrollen, werden in die Perfusionskammer geleitet.

Nehmen Sie mit der Mikroskopsoftware einen Zeitrafferfilm auf, der alle fünf Sekunden für 15 bis 20 Minuten aufgenommen wird. Konditionieren Sie eine neue Perfusionsvertiefung und ersetzen Sie das Puffervolumen durch das regulatorische Protein von Interesse und die Pufferkontrollen. Erwerben Sie, um die regulatorischen Proteine für emergente Aktin-Mikrotubuli-Funktionen zu bewerten.