Intravitale Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der mikrovaskulären Thrombusbildung

Die Intravital-Fluoreszenzmikroskopie ist nützlich, um die phototoxische Induktion der Bildung eines Thrombus – eines Blutgerinnsels – an einer mikrovaskulären Verletzungsstelle zu untersuchen.

Beginnen Sie damit, eine betäubte, haarlose Maus zu nehmen, die mit einem phototoxischen Fluorophor-markierten Polysaccharid injiziert wurde. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf einer Heizplattform, um die physiologische Temperatur für eine gute Durchblutung aufrechtzuerhalten.

Platzieren Sie den apikalen Teil des Ohres unter einem Intravital-Fluoreszenzmikroskop. Bei Anregung mit Licht emittiert das Fluorophor Fluoreszenz und ermöglicht so die Überwachung des mikrovaskulären Blutflusses. Erhöhen Sie die Lichtintensität, um die Thrombusbildung zu induzieren.

Das Fluorophor absorbiert das hochintensive Licht und reagiert mit molekularem Sauerstoff, um reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen. Diese Moleküle verursachen oxidativen Stress in den Endothelzellen, was zu Zellschäden und der Freilegung der subendothelialen Matrix führt.

Die geschädigten Zellen setzen thrombotische Mediatoren frei, die das freiliegende Kollagen in der subendothelialen Matrix und die zirkulierenden Blutplättchen überbrücken, die über spezifische Rezeptoren an die Mediatoren binden.

Die Bindung aktiviert die Blutplättchen, wodurch Effektormoleküle freigesetzt werden, die andere zirkulierende Blutplättchen aktivieren und an die Verletzungsstelle rekrutieren. Zirkulierende Fibrinogenproteine binden an die Fibrinogenrezeptoren auf den aktivierten Blutplättchen – und verbinden sie zu einem Blutplättchenpfropfen.

Visualisieren Sie den eingeschränkten Blutfluss, um den Blutplättchenpfropfen zu bestätigen – den primären Schritt der Thrombusbildung.

Platzieren Sie das Tier auf der Plattform unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerung. Für die Mikroskopie des rechten Ohrs bereiten Sie die linke Halsvene vor, indem Sie zunächst einen 5-Millimeter-Schnitt in der Haut des Halses in kraniokaudaler Richtung erstellen. Verwenden Sie dann eine Mikrozange und eine Mikroschere, um das Unterhautgewebe zu präparieren. Befreien Sie dann die Vene von ihrer Adventitia, ohne das Gefäß zu berühren.

Verwenden Sie nun die zuvor vorbereitete Insulinspritze für die Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs. Fassen Sie die Gefäßwand vorsichtig mit der Mikrozange an, ohne die Vene zu perforieren. Mit der Spritzennadel in die aufgeblähte Gefäßwand eindringen und FITC-Dextran intravenös injizieren. Ziehen Sie die Nadel zurück und stoppen Sie die Blutung mit Wattestäbchen. Vermeiden Sie eine Kontamination des Ohrs mit Blut und Farbstoffen.

Übertragen Sie das Tier auf der Heizplatte in eine akrale Glaskonstruktion mit einem Schlitz für die Heizplatte und einer 0,5 Zentimeter hohen Ebene zur Positionierung des Ohrs. Fixieren Sie das Tier in Bauchlage auf der Heizplatte mit einem Klebeverband. Platzieren Sie den konvexen Knorpel an der Basis des Ohres neben der Ebene für das Ohr, so dass der apikale Teil des Ohres flach auf der Ebene positioniert werden kann. Geben Sie einen Tropfen Aqua bei Raumtemperatur auf die Akralglasplatte. Nehmen Sie mit Wattestäbchen den Tropfen Aqua auf und lassen Sie die Kapillarkräfte die Ohrplane am Akralglas befestigen.

Die Ohrmuschel muss so flach wie möglich positioniert werden, auch wenn der Knorpel der Ohrmuschel eine konvexe Form verleiht. Es sollte also nur der flexiblere distale Teil der Ohrmuschel auf der akralen Glasplatte positioniert werden. Um Gewebeschäden und Extravasation des gefrorenen Farbstoffs zu vermeiden, berühren Sie das Ohr so wenig wie möglich mit der Pinzette.

Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Aqua auf die konvexe dorsale Seite des Ohrs. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Ohr, ohne die in das Ohr eintretenden Basalgefäße zusammenzudrücken. Verwenden Sie Wattestäbchen, um so viel Wasser wie möglich unter dem Deckglas zu entfernen, um den Abstand zwischen dem Deckglas und den Zielgefäßen im Ohr zu minimieren.

Beginnen Sie mit der Einstellung des Intravital-Fluoreszenzmikroskops für die FITC-Dextran-Visualisierung. Bringen Sie das vorbereitete Tier auf den Schreibtisch des Intravital-Fluoreszenzmikroskops. Suchen Sie mit 5-facher, 10- und 20-facher Vergrößerung und 20 % Lichtintensität nach einem venösen Gefäß mit einem Durchmesser von 50 bis 60 Mikrometern und einem anterograden Blutfluss.

Geben Sie einen Tropfen Wasser mit Raumtemperatur auf das Deckglas, um das Objektiv mit 63-facher Vergrößerung in Wasser einzutauchen. Beginnen Sie unmittelbar nach dem Auftragen des Wassertropfens mit der Aufzeichnung des Gefäßes für 20 Sekunden zur Beurteilung des Durchmessers und des Blutflusses. Beginnen Sie die Thrombusinduktion 5 Minuten nach der Injektion von FITC-Dextran. Erhöhen Sie dazu die Lichtintensität auf 100%.

Schließen Sie während der Induktion phototoxischer Thromben die Öffnung des Mikroskops innerhalb von 30 Sekunden für 2 Sekunden, um zu überprüfen, ob der Blutfluss okklusiert ist. Wenn der Blutfluss anhält, öffnen Sie die Öffnung wieder. Das Gefäß wird als verschlossen eingestuft, wenn der Blutfluss 30 Sekunden oder länger stillsteht oder wenn der Blutfluss retrograd ist. Auswahl und Verschluss von fünf Gefäßen pro Ohr innerhalb eines Zeitraums von 1 Stunde nach Injektion von FITC-Dextran.