Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Um spezifische DNA-Schadensreaktionsproteine an DNA-Doppelstrangbruchstellen (DSB) mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie zu visualisieren, beginnen Sie mit Objektträgern, die humane mononukleäre Zellmonoschichten mit DSBs enthalten. Fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd.

Mit einem nichtionischen Detergens behandeln, das Membranen für den Zugang zu intrazellulären Zielen permeabilisiert. Fügen Sie eine proteinhaltige Blockierungslösung hinzu, die die unspezifischen Bindungsstellen der Zellen blockiert. Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die an die Zielreaktionsproteine binden.

Die Behandlung erfolgt mit einer sekundären Antikörpermischung, die mit verschiedenen Fluorophoren markiert ist, um spezifisch an ihre jeweiligen primären Antikörper zu binden, die an die Proteine gebunden sind. DNA mit DAPI färben. Eindeckmedium hinzufügen; Montieren Sie das Deckglas.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie erreicht der einfallende Lichtstrahl den Anregungsfilter, wodurch Licht einer bestimmten Anregungswellenlänge durchgelassen wird. Beim Erreichen des dichroitischen Spiegels – eines Strahlteilers – reflektiert das Anregungslicht selektiv in Richtung der Objektivlinse, die das Licht auf die Probe fokussiert.

Das einfallende Anregungslicht regt die Elektronen des Fluorophors in einen höheren Energiezustand an. Bei der Rückkehr in den Grundzustand emittieren die Elektronen Licht mit einer längeren Wellenlänge, das von der Objektivlinse gesammelt und an den dichroitischen Spiegel zurückgegeben wird.

Der Spiegel lässt das emittierte Fluoreszenzlicht durch den Emissionsfilter passieren, wodurch nur das gewünschte Fluoreszenzlicht den Detektor erreicht. Verarbeiten Sie die Bilder. Analysieren Sie die verschiedenfarbigen Fluoreszenzherde, um die Kolokalisation der DNA-Schadensreaktionsproteine an der DSB-Stelle sichtbar zu machen.

Präparation von zwei Zytospins mit mononukleären Zellen der Patientenproben durch Zentrifugation von 1 x 10⁵ Zellen für jede Präparation. Fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 4% PFA für 10 Minuten.

Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern PBS für jeweils fünf Minuten auf einem Shaker. Dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,1% Octoxinol-9 für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern 5%iger Blockierungslösung für jeweils fünf Minuten auf einem Laborschüttler. Blockieren Sie die Zellen eine Stunde lang in 30 Millilitern frischer 5%iger Blockierungslösung.

Durch die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen mit 4% Paraformaldehyd und 0,1% Octoxinol-9 blieben die gamma H2AX und 53BP1 Foci deutlich erhalten.

Inkubieren Sie ein Präparat der Zellen mit einem monoklonalen Maus-Anti-Gamma-H2AX-Antikörper und das andere Präparat der Zellen mit einem monoklonalen Maus-Anti-Gamma-H2AX-Antikörper und einem polyklonalen Kaninchen-Anti-53BP1-Antikörper über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Die Verwendung von bewährten Anti-Gamma-H2AX- und Anti-53BP1-Antikörpern wird dringend empfohlen.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern 2%iger Blockierungslösung für jeweils fünf Minuten auf einem Laborschüttler.

Als nächstes inkubieren Sie die erste Präparation der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper, der 1 zu 500 in einer 2%igen Blockierungslösung verdünnt ist. Inkubieren Sie die zweite Vorbereitung der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper und einem Alexa555-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der 1 zu 500 in einer 2%igen Blockierungslösung verdünnt ist.

Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern PBS auf einem Laborschüttler. Entfernen Sie das PBS und mounten Sie die Zellen mit Eindeckmedium. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmedium, damit keine Luftblasen eingebettet werden. Warten Sie mindestens drei Stunden, bis das Eindeckmedium ausgehärtet ist, bevor Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie analysieren.

Analysieren Sie abschließend die gamma H2AX- und 53BP1-Foki in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Filtern für DAPI, Alexa488 und Cy3 ausgestattet ist, während der Bildgebung bei einer 100-fachen Objektivvergrößerung.