Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Um spezifische DNA-Schadensreaktionsproteine an DNA-Doppelstrangbruchstellen (DSB) mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie zu visualisieren, beginnen Sie mit Objektträgern, die humane mononukleäre Zellmonoschichten mit DSBs enthalten. Fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd.

Mit einem nichtionischen Detergens behandeln, das Membranen für den Zugang zu intrazellulären Zielen permeabilisiert. Fügen Sie eine proteinhaltige Blockierungslösung hinzu, die die unspezifischen Bindungsstellen der Zellen blockiert. Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die an die Zielreaktionsproteine binden.

Die Behandlung erfolgt mit einer sekundären Antikörpermischung, die mit verschiedenen Fluorophoren markiert ist, um spezifisch an ihre jeweiligen primären Antikörper zu binden, die an die Proteine gebunden sind. DNA mit DAPI färben. Eindeckmedium hinzufügen; Montieren Sie das Deckglas.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie erreicht der einfallende Lichtstrahl den Anregungsfilter, wodurch Licht einer bestimmten Anregungswellenlänge durchgelassen wird. Beim Erreichen des dichroitischen Spiegels – eines Strahlteilers – reflektiert das Anregungslicht selektiv in Richtung der Objektivlinse, die das Licht a