Kernspinresonanzspektroskopie zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen in Proteinen

Bei mehrfachen Phosphorylierungen in einem Protein werden dem Protein Phosphatgruppen an verschiedenen Positionen hinzugefügt, insbesondere an Serin- und Threoninresten.

Um mehrere Phosphorylierungen in einem Protein zu identifizieren, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit phosphorylierten Proteinen, die mit Stickstoff-15 markiert sind, was hilft, Amidwasserstoffe von anderen Wasserstoffatomen im Protein zu unterscheiden.

Fügen Sie eine interne NMR-Referenzverbindung hinzu, um die relativen Resonanzfrequenzen genau zu messen. Gib das Gemisch in ein Kernspinresonanz-Röhrchen (NMR). Setzen Sie den Tubus in eine rotierende Öffnung ein und platzieren Sie ihn in einem NMR-Spektrometer.

Das Vorhandensein von Phosphaten zeigt elektronenentziehende Effekte in den phosphorylierten Serin- und Threoninresten. Infolgedessen scheinen die Amidwasserstoffe der phosphorylierten Reste im Vergleich zu den anderen Amidwasserstoffen mit geringeren Elektronendichten abgeschirmt zu sein.

Amid-Wasserstoffatome mit unterschiedlichen elektronischen Umgebungen erleben differentielle Magnetfelder um Kerne und erreichen so niederenergetische Zustände.

Wenden Sie einen kurzen Hochfrequenzimpuls an, um die Wasserstoffkerne auf einen höheren Energiezustand bei einer bestimmten Resonanzfrequenz anzuregen, die auf ihrer elektronischen Umgebung basiert.

Während der Relaxation kehren die Kerne in einen niederenergetischen Zustand zurück, indem sie die absorbierte Energie freisetzen, die als NMR-Signal detektiert wird.

Zeichnen Sie ein zweidimensionales NMR-Spektrum, das die einzelnen Amid-Wasserstoffatome darstellt.

Vergleichen Sie das Spektrum des phosphorylierten Proteins mit dem des nicht phosphorylierten Proteins. Das Auftreten zusätzlicher Resonanzen im NMR-Spektrum des phosphorylierten Proteins bestätigt mehrere Phosphorylierungen.

Solubilisieren Sie 4 Milligramm lyophilisiertes ¹⁵N und ¹³C angereichertes ERK-phosphoryliertes Tau in 400 Mikrolitern NMR-Puffer. Fügen Sie 5 % Deuteriumoxid für die Feldblockierung des NMR-Spektrometers und 1 Millimolar TMSP als interne NMR-Signalreferenz hinzu. Fügen Sie außerdem 10 Mikroliter einer 40-fachen Stammlösung eines vollständigen Proteasehemmer-Cocktails hinzu.

Die Probe wird in ein 5-Milliliter-NMR-Röhrchen mit einer elektronischen Spritze mit langer Nadel oder mit einer Pasteurpipette überführt. Verschließen Sie den NMR-Schlauch mit dem Kolben. Entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen dem Kolben und der Flüssigkeit eingeschlossen sind, indem Sie den Kolben bewegen.

Setze den NMR-Schlauch in einen Spinner ein. Verwenden Sie das entsprechende Messgerät, um die vertikale Position im Spinner so einzustellen, dass sich der größte Teil der Probenlösung in der NMR-Spule befindet. Starten Sie anschließend den Luftstrom im NMR-Instrument, indem Sie im Fenster des Magnetsteuerungssystems auf "Heben" klicken. Platzieren Sie den Spinner vorsichtig mit dem Rohr im Luftstrom am oberen Ende der Magnetbohrung, stoppen Sie dann den Luftstrom und lassen Sie das Rohr in den Sondenkopf im Magneten einsinken.

Nachdem Sie die Probe auf 25 Grad Celsius äquilibriert haben, geben Sie "atmm" in die Befehlszeile ein, um eine halbautomatische Abstimmung und Anpassung des Sondenkopfes durchzuführen und die Energieübertragung zu optimieren. Klicken Sie dann im Fenster des Magnetsteuerungssystems auf "Sperren", um die Feldfrequenzsperre des Spektrometers zu aktivieren.

Starten Sie den Shimming-Vorgang, um die Homogenität des Magnetfelds an der Position der Probe zu optimieren, indem Sie zuerst "topshim gui" in die Befehlszeile eingeben, um das Shim-Fenster zu öffnen. Klicken Sie dann im Shim-Fenster auf "Start". Überprüfen Sie die Standardabweichung von Null für Rest-B, um sicherzustellen, dass die Unterlegscheiben optimal sind.

Kalibrieren Sie als Nächstes den P1-Parameter, der die Länge eines Protonen-Hochfrequenzpulses in Mikrosekunden angibt. Dieser Parameter ist notwendig, um eine 90-Grad-Drehung der Protonenspinmagnetisierung zu erhalten. Streben Sie den 360-Grad-Puls mit einem eindimensionalen Spektrum von Wasserprotonen an.

Passen Sie den Frequenzversatz an, indem Sie den Parameter 01 auf die Protonenwasserfrequenz im eindimensionalen Spektrum einstellen. Starten Sie schließlich die Erfassung eines eindimensionalen Protonenspektrums, indem Sie "zg" in die Befehlszeile eingeben.