Ein auf Raman-Spektroskopie basierender direkter Immunoassay zum Nachweis eines spezifischen Antigens

Beginnen Sie mit der Inkubation von Raman-Reporterfarbstoffmolekülen mit Goldnanopartikeln, damit Reporter an die Nanopartikel binden können.

Fügen Sie Polyethylenglykol und PEG-konjugierte Antikörper hinzu, die spezifisch für das Zielantigen sind. Die Antikörper binden sich durch Gold-Disulfid-Bindung kovalent an die Nanopartikel. Fügen Sie Thiol-konjugierte PEGs hinzu, um die verbleibenden Nanopartikelstellen zu blockieren und die Aggregation von Nanopartikeln zu verhindern, wodurch Nanopartikelsonden gebildet werden.

die Immunoassay-Plattenvertiefungen mit dem Zielantigen. Blockieren Sie die verbleibenden Plattenstellen mit einer proteinhaltigen Lösung. Fügen Sie die Nanopartikelsonden hinzu. Führen Sie eine serielle Sondenverdünnung über die Vertiefungen durch. Inkubieren Sie, bis die Antikörper in den Sonden an die Antigene binden und Komplexe bilden.

Verwenden Sie ein Raman-Mikroskop, um die optische Reaktion der Sonde zu bestimmen. Der einfallende monochromatische Laser regt die Oberflächenelektronen der Goldnanopartikel an und bewirkt deren Schwingung, wodurch ein hohes lokales elektromagnetisches Feld auf der Sondenoberfläche entsteht.

Der einfallende Strahl und die Raman-Reporter interagieren, was aufgrund des verstärkten elektromagnetischen Feldes zu verstärktem inelastischem Licht oder Raman-Streuung mit unterschiedlichen Wellenlängen und Frequenzen führt. Das unelastisch ausgestrahlte Raman-Signal wird zur Erzeugung des Raman-Spektrums verwendet.

Plotten Sie den Spektralbereich des Raman-Reporterpeaks gegen die Sondenkonzentration, um die untere Grenze des Sondennachweises zu ermitteln und einen empfindlicheren Nachweis des Antigens zu ermöglichen.

Um die Raman-Sonden vorzubereiten, stellen Sie zunächst zwei 1,5-Milliliter-Chargen von Goldnanopartikeln und den Raman-Reporter in Konzentrationen her, die wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben bestimmt sind.

Dies geschieht, indem der Raman-Reporter und die Goldnanopartikellösungen kombiniert und über 30 Minuten bei Raumtemperatur gebunden werden. Fügen Sie dann die PEGylierte Antikörperlösung zu einer der reportergebundenen Goldnanopartikellösungen hinzu, um ein Verhältnis von Antikörpern zu Partikeln von 200 zu 1 zu erzeugen. Diese Lösung gilt für die Testmuster.

In einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen wird ein PEGyliertes Antigen zu der anderen reportergebundenen Goldnanopartikellösung in einem Verhältnis von 200 zu 1 von Antigen zu Partikeln hinzugefügt, das als Kontrolle verwendet werden soll. Inkubieren Sie beide Lösungen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Blockieren Sie als Nächstes die restlichen Stellen auf der Nanopartikeloberfläche. Um dies zu erreichen, lösen Sie zunächst festes Methoxypolyethylenglykolthiol mit HPLC-Wasser auf eine Konzentration von 200 Mikromolaren auf. Wirbeln Sie die Lösung, bis sich das Thiol vollständig aufgelöst hat. Fügen Sie dann die Thiollösung in einem Verhältnis von 40.000 zu 1 zu den nanopartikelgebundenen PEG-Antikörperlösungen hinzu und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Stellen auf dem Goldnanopartikel blockiert sind.

Als nächstes werden die funktionalisierten Raman-Sonden zurückgewonnen, indem die Partikel in niedrig gebundenen Zentrifugenröhrchen zentrifugiert werden, so dass der Überstand klar ist. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, aber achten Sie darauf, die Nanopartikel nicht zu stören. Dann resuspendieren Sie die Nanopartikel mit 1 Milliliter PBS.

Schätzen Sie die Konzentration von Goldnanopartikeln, indem Sie eine UV-sichtbare Messung von etwa drei Mikrolitern der Lösung vornehmen und vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen einer bekannten Goldnanopartikelkonzentration, da es sich um eine lineare Beziehung handelt.

Wenn die Nanopartikel nicht ausreichend blockiert sind, aggregieren sie aufgrund von Adhäsionskräften zwischen den Partikeln, was darauf hindeutet, dass die Reagenzien in den falschen Konzentrationen zugegeben wurden. Normalerweise ist die Lösung eine tiefrote Farbe, aber durch die Aggregation entsteht ein grauer Farbton.

Das Volumen wird so eingestellt, dass die endgültigen Lösungen mindestens 1 x 10¹¹ Partikel pro Milliliter betragen, und die Lösungen werden bei 4 Grad Celsius gelagert, bis sie zur Funktionalisierung der Immunoassay-Platte verwendet werden. Verwenden Sie diese Lösungen innerhalb einer Woche. Bereiten Sie zunächst genügend des verdünnten Antigens vor, um die Polystyrol-Vertiefungen zu füllen. Wirbeln Sie dann die Lösung und geben Sie die Lösung sofort in die Vertiefungen der Platten.

Lassen Sie das Antigen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur an die Platten binden. Entfernen Sie dann die überschüssige Antigenlösung, indem Sie die Lösung ausschütten und die Platte gegen eine mit Papiertüchern bedeckte Tischplatte schlagen. Geben Sie TBST in die Vertiefungen, um die Oberfläche zu waschen. Entferne dann die Wäsche, indem du die Lösung erneut ausgießt und den Teller gegen eine mit Papiertüchern bedeckte Tischplatte schlägst.

Blockieren Sie als Nächstes die verbleibenden Bindungsstellen auf der Platte, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, indem Sie 70 Mikroliter HSA-blockierende Lösung in jede Vertiefung der Platte geben und die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie dann die Blockierungslösung und spülen Sie die Platte dreimal mit TBST aus, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie die letzte Spülung entfernt haben, decken Sie die Platte ab und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung trocken bei 4 Grad Celsius.

Geben Sie 140 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Sonden-Nanopartikel in die erste Säule einer 96-Well-Platte, wobei die Test-Nanopartikel in den ersten fünf Reihen und die Kontroll-Nanopartikel in den letzten drei Reihen platziert werden. Fügen Sie 70 Mikroliter PBS zu allen anderen Spalten hinzu.

Verdünnen Sie jede Säule mit einer seriellen Verdünnung von 1 bis 2. Beginnen Sie damit, 70 Mikroliter aus der ersten Säule zu nehmen und sie mit der zweiten zu mischen. Nehmen Sie dann 70 Mikroliter aus der zweiten Spalte und fügen Sie sie der dritten hinzu und so weiter. Lassen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang inkubieren.

Entfernen Sie dann die ungebundenen Nanopartikelsonden und waschen Sie die Platte fünfmal mit TBST, wie zuvor gezeigt. Geben Sie nach der letzten Wäsche 70 Mikroliter PBS in jede Vertiefung und decken Sie die Platte mit einer Plattenversiegelung ab. Prüfen Sie, ob die Kontrollproben klar sind. Wenn eine unspezifische Bindung aufgetreten ist, haben die Kontrollproben eine ähnliche Farbe wie die Testproben.

Fokussieren Sie das Objektiv mit einem inversen Raman-Mikroskop auf die Oberfläche der Vertiefung, in der sich die Goldnanopartikelsonden befinden. Erhalten Sie Raman-Spektren des Bohrlochs. Sammeln Sie ein Spektrum von 1800 inversen Zentimetern bis 400 inversen Zentimetern und wiederholen Sie dies für jede Vertiefung. Befolgen Sie abschließend die Schritte im letzten Abschnitt des begleitenden Textprotokolls, um die Empfindlichkeit des Setups zu bestimmen.