Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schritte zur Verwendung des Lookout-Mykoplasma-PCR-Nachweiskits, das zur Detektion von Mykoplasmenkontamination optimiert ist, visuell zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem die Proben zunächst auf 95 Grad Celsius erhitzt werden, um jegliche DNA-Moleküle zu inaktivieren, die die gewünschte Vorlage für die PCR ungeeignet machen könnten. Anschließend bereiten Sie die Proben mithilfe der bereitgestellten Röhrchen, die bereits mit Nukleotiden, Primern und interner Kontroll-DNA vorcodiert sind, für die PCR vor.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist der Temperaturzyklus unter sorgfältig optimierten Bedingungen, um die höchste Empfindlichkeit zu erzielen und unspezifische Amplifikation auszuschließen. Letztendlich können Ergebnisse gewonnen werden, um durch Auswertung mittels Agarose-Gelelektrophorese festzustellen, ob die betreffenden Proben mit Mykoplasmen kontaminiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Reagenzien vorausgemischt sind und hochwertige PCR-Röhrchen verwendet werden.

Dies macht es bequemer und effizienter. Ein weiterer Vorteil dieses Kits besteht darin, dass weniger als zwei Mykoplasma-Genome pro Mikroliter Probe benötigt werden, um eine Kontamination nachzuweisen. Bei der Durchführung des Verfahrens zum Nachweis von Mykoplasmen ist es wichtig, jegliche mögliche Kontamination zu vermeiden, indem geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen wird, um die Hautexposition auf ein Minimum zu reduzieren, sichergestellt wird, dass alle verwendeten Reagenzien frei von Kontaminationen sind, und jederzeit eine korrekte aseptische Technik angewandt wird.

Das Verfahren kann entweder direkt an Kulturüberständen von Zellen durchgeführt werden, oder die Proben können für eine spätere Verwendung vorbereitet werden. Zum Vorbereiten der Proben für die spätere Verwendung jeweils 100 µL des Überstandes in ein steriles Amplifikationsröhrchen geben und fünf Minuten bei 95 °C inkubieren. Nach der Inkubation können die Proben bis zu einer Woche lang bei 2 bis 8 °C gelagert werden.

Kurz vor dem Testen der Proben kurz zentrifugieren, um zellulären Abfall zu pelletieren. Um die Proben für die PCR vorzubereiten, zunächst das Gesamtvolumen an DNA-Polymerase-Rehydratisierungspuffer bestimmen, das für die Reaktionen erforderlich ist. Eine Einheit DNA-Polymerase pro Reaktion sollte zur entsprechenden Menge Rehydratisierungspuffer hinzugefügt werden, die je nach verwendeter TAC variieren kann. In dieser Demonstration wird jumpstart TAC D 93 0 7 in fünf Reaktionen verwendet, drei Proben sowie eine positive Kontrolle und eine negative Kontrolle.

Geben Sie das berechnete Volumen der DNA-Polymerase in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie anschließend das berechnete Volumen des Rehydratisierungspuffers hinzu. Mischen Sie den Rehydratisierungspuffer für die DNA-Polymerase vorsichtig durch leichtes Anstoßen des Röhrchens. Vortexen Sie diese Mischung nicht.

Verwenden Sie die durchsichtigen Reaktionsgefäße, die im Kit enthalten sind, um die negative Kontrolle und die Proben vorzubereiten. Diese Reaktionsgefäße enthalten bereits die Nukleotide, Primer und interne Kontroll-DNA. Pipettieren Sie jeweils 23 Mikroliter des zuvor vorbereiteten DNA-Polymerase-Rehydratisierungspuffers in die Gefäße der negativen Kontrolle und der Proben. Mischen Sie jeweils gründlich an.

Dann zwei Mikroliter DNA-freies Wasser zur Negativkontrolle und zwei Mikroliter jeder Probe zu den jeweiligen Probengefäßen hinzufügen. Den Inhalt durch leichtes Anstoßen der Gefäße mischen. Der Inhalt darf nicht vortexiert werden.

Um die positive Kontrolle vorzubereiten, verwenden Sie die rosa Reaktionsröhrchen, die im Kit enthalten sind. Diese Reaktionsröhrchen enthalten bereits die Nukleotide, Primer und interne Kontroll-DNA. Geben Sie 25 µL DNA-Polymerase-Rehydratisierungspuffer-Mix zu dem Reaktionsröhrchen hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch leichtes Anstoßen des Röhrchens; der Inhalt sollte nicht verwirbelt werden.

Anschießend werden die positiven und negativen Kontrollen sowie die Probenröhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünf Minuten werden alle Reaktionsröhrchen in einen Thermocycler überführt. Für die PCR werden die folgenden Bedingungen über 40 Zyklen eingestellt.

94 Grad Celsius für 30 Sekunden. 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 40 Sekunden. Ein Aktivierungsschritt ist nicht erforderlich, wenn Jumpstart tack verwendet wird.

Nach Abschluss der PCR-Zyklen entnehmen Sie die Proben dem Thermocycler und stellen sie zum Abkühlen auf Eis, um sie auf vier bis acht Grad Celsius abzukühlen. Anschließend können die Proben direkt auf ein Agarosegel zur Elektrophorese aufgetragen werden; geben Sie acht Mikroliter jeder PCR-Reaktion in eine separate Spur. Lade-Puffer und Farbstoff müssen vor dem Beladen der Proben nicht hinzugefügt werden, da sie bereits in den Reaktionsgefäßen enthalten sind.

Beenden Sie die Elektrophorese, nachdem sich der Laufindikator 2,5 bis drei Zentimeter bewegt hat. In diesem Bild einer Agarose-Geleleiste sind repräsentative Ergebnisse der Mykoplasmen-Detektion mittels PCR dargestellt. Lane 2 ist die negative Kontrolle, die eine Bande bei etwa 481 Basenpaaren aufweisen sollte.

Das Fehlen des Negativkontrollbands bei 481 Basenpaaren ist ein guter Hinweis darauf, dass die verwendete TAC nicht empfindlich genug war. Mykoplasma-positive Proben zeigen Bänder im Bereich von 270 ± acht Basenpaaren, wie in den Gelen in den Spuren drei bis sechs dargestellt. Das Band ist bei stark kontaminierten Proben intensiv und bei schwach kontaminierten Proben schwach ausgeprägt.

Alle Proben enthalten eine interne negative Kontrolle, um zu zeigen, dass die PCR wie erwartet abgelaufen ist. Es ist normal, dass bei stark kontaminierten Proben die interne Kontrolle fehlt. Das Fehlen eines Bands sowohl im positiven als auch im negativen Bereich, wie in Lane sieben gezeigt, ist ein guter Hinweis darauf, dass die Proben gehemmt sind.

Wenn die Probe gehemmt ist, können die PCR-Inhibitoren durch eine DNA-Extraktion entfernt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie alle im Kit-Protokoll beschriebenen notwendigen Schritte durchgeführt, die Ergebnisse interpretiert und gegebenenfalls Probleme behoben werden können.