In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs) sind Immunzellen, die auf eine Infektion reagieren, indem sie das Zytokin Typ-I-Interferon produzieren.

Um pDCs in vitro zu erzeugen, wird eine Suspension von gewöhnlichen lymphatischen Vorläuferzellen (CLPs) entnommen, die aus dem Knochenmark der Maus isoliert wurden. CLPs können sich in Lymphozyten und dendritische Zellen differenzieren.

Geben Sie die Zellsuspension über eine Schicht von Feeder-Zellen - adhärente Stromazellen -, die mit Gammastrahlen bestrahlt werden, um die Proliferation zu hemmen. Die Feeder-Zellen liefern Zytokine und Zell-Zell-Kontakte, die für die Differenzierung von CLPs erforderlich sind.

Fügen Sie eine angemessene Konzentration des Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden oder FL hinzu – ein bivalentes Zytokin, das die pDC-Entwicklung fördert – und inkubieren.

Die CLPs wandern zwischen den Feeder-Zellen und vermehren sich, um Zellgruppen zu bilden, die als Kopfsteinpflasterbereiche bezeichnet werden.

Das FL im Medium bindet an den Flt3-Rezeptor – einen Tyrosinkinase-Rezeptor – auf den CLPs. Die Bindung induziert die Rezeptordimerisierung und die Autophosphorylierung der Tyrosinreste auf der zytoplasmatischen Domäne.

Zytoplasmatische Adapterproteine binden an diese Reste und werden phosphoryliert, wodurch das Signal an die nachgeschalteten Signalkomponenten weitergeleitet wird. Die Signalkaskade bewirkt die Differenzierung von CLPs in pDCs – kleine runde Zellen, die in Suspension wachsen – sowie in konventionelle dendritische Zellen (cDCs) – größere spindelförmige adhärente Zellen.

Sammeln Sie die Zellen. Fügen Sie Antikörper gegen pDC- und cDC-spezifische Oberflächenmarker hinzu. Analysieren Sie die Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

positiv für pDC-spezifische Marker und negativ für cDC-spezifische Marker sind, deuten auf eine erfolgreiche pDC-Entwicklung hin.

Um die gängigen lymphatischen Vorläuferzellen (CLPs) mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wird anschließend F_c die Zellen für ein bis zwei Minuten mit Anti-CD16/32 blockiert, gefolgt von einer gleichzeitigen Färbung der Zellen mit dem entsprechenden Antikörpercocktail.

Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten auf Eis in drei Millilitern FACS-Puffer und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern frischem FACS-Puffer. Filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb und sortieren Sie die Zellen sofort auf einem Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern und Spannungen, indem Sie die interessierenden Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit 8 Millilitern vollständigem RPMI sammeln.

Um eine hochangereicherte pDC-Population zu erzeugen, ist es entscheidend, die richtige Population von CLPs aus entnommenen Knochenmarkzellen für die In-vitro-Kultur mit dem AC-6-Feeder-System zu sortieren.

Am Ende der Sortierung schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie das CLP-Zellpellet mit genügend vollständigem RPMI, um eine Zelldichte von etwa 5 mal 10 bis 4 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Als nächstes säen Sie 500 Zellen pro Vertiefung in die 12-Well-Platte, die die AC-6-Feederzellen enthält, und ergänzen Sie die Co-Kulturen mit 100 Nanogramm pro Milliliter FLT3-Liganden. Inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit regelmäßiger visueller Überwachung der dendritischen Zelle oder DC-Entwicklung unter einem Mikroskop.

Ernten Sie am 12. Tag die Zellen im Co-Kultur-Überstand und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit einem halben Milliliter vollständigem RPMI-Medium, wobei Sie die resultierenden Überstände und Waschungen zusammenfassen. Geben Sie dann einen halben Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung und verwenden Sie einen Zellschaber, um die anhaftenden Zellen zu lösen. Kombinieren Sie die abgelösten Zellen mit den schwimmenden Zellen und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension, wobei das Pellet in 50 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendiert wird.

Zählen Sie dann die Zellen und färben Sie sie nach der F_{c-Blockierung} auf CD11c-, CD11b- und B220-Expression, wie gerade gezeigt. Die co-kultivierten Zellen können dann auf das Vorhandensein von konventionellen CD11c-positiven, CD11b-positiven, B220-negativen und plasmazytoiden CD11c-positiven, CD11b-negativen und B220-positiven DC-Populationen analysiert werden.