Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Steroidrezeptor-HSB-90-Proteinkomplex biochemisch neu zusammenzusetzen und die Ligandenbindungsaktivität des Steroidrezeptors wiederherzustellen, was zur Untersuchung der Kofaktoranforderungen von HSB 90 sowie der Auswirkungen der Zugabe exogener Substanzen zum Rekonstitutionsprozess genutzt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Zellzytosol mit funktionellen Glukokortikoidrezeptoren hergestellt wird. Anschließend wird der GR aus dem Zellzytosol immunpräzipitiert und endogen.

HSP 90 wird dissoziiert. Anschließend wird der GR-HSP-90-Heterokomplex unter Verwendung einer exogenen HSP-90-Quelle sowie weiterer Chaperonproteine und Cofaktoren rekonstituiert. Schließlich werden die rekonstituierten Protein-Komplexe und ihre Ligandenbindungsaktivität analysiert; spezifische Methoden wie SDS-PAGE, Western Blotting und radioaktive Ligandenbindungsassays werden eingesetzt, um die Bildung des GR-HSP-90-Heterokomplexes und die Steroidbindungsaktivität nachzuweisen.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich des molekularen Chaperons HSP90 beantworten, beispielsweise welche Cofaktor-Chaperone und COS-Chaperone erforderlich sind, um die funktionelle Aktivität von HSP90 zu unterstützen. Obwohl diese Methode Einblicke in den Prozess der Proteinfaltung ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise die Entwicklung von HSP90-abhängigen Leitstrukturen oder die Analyse von intrazellulären Signalwegen, die HSP90 benötigen. Den Versuchsaufbau demonstrieren Hannah Franklin und Nathan für AWA, zwei kürzlich aus meinem Labor hervorgegangene Absolventen. Um funktionelles Glucocorticoidrezeptor (GR) zu isolieren, kultivieren Sie murine Fibroblasten der L-929-Zelllinie oder SF9-Zellen, die mit einem rekombinanten GR-Baculovirus infiziert wurden und sich in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 ×g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Das resultierende Pellet sollte ein Volumen von etwa ein bis fünf Millilitern haben. Waschen Sie das Zellpellet dreimal mit jeweils 15 Millilitern Hank’s Buffered Saline Solution. Bereiten Sie 1,5 Volumina Puffer für die Homogenisierung vor, der HEM-Puffer, ein Millimolar Phenylmethylsulfonylfluorid oder PMSF und drei gemahlene Complete Mini-Proteaseinhibitor-Tabletten enthält, die durch 50 Stöße in einem Mörser zerkleinert wurden.

Der Homogenisator zerstörte die Zellen; führen Sie den Schritt auf Eis durch, um den Proteinabbau zu verhindern. Zentrifugieren Sie das Homogenat in der Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Portionieren Sie das Überstand enthaltende Zytoplasma in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu jeweils 500 Mikrolitern und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius.

Zur Herstellung einer Mischung, die einen monoklonalen IgG-Antikörper gegen den rezeptorspezifischen GR enthält, mischen Sie 100 Mikroliter aufgetauten GR-haltigen Zytosol, 200 Mikroliter TEGM-Puffer, 100 Mikroliter einer 20 %-igen Protein-A-Sero- oder PAS-Suspension und fünf Mikrogramm eines monoklonalen IgG-Antikörpers gegen G, beispielsweise Bugger zwei. Aufgrund der relativ großen Größe der PAS-Kügelchen.

Verwenden Sie eine abgeschnittene P-200-Pipettenspitze, um PAS von der 20%-Suspension in die Probenröhrchen zu überführen. Stellen Sie die Proben auf ein vertikales Rotationsgerät und inkubieren Sie sie mindestens zwei Stunden bei konstanter Drehung. Entfernen Sie anschließend die nicht gebundenen Proteine aus dem Antikörper-PAS-Pellet, indem Sie die Proben eine Minute lang in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugieren.

Bei 10.000 G waschen Sie das Pellet zweimal, indem Sie ein Milliliter TEGM-Puffer hinzufügen, vortexen und anschließend zentrifugieren. Entfernen Sie die letzte Waschung mit einer abgeflachten P-200-Pipettenspitze, um endogenes HSB 90 vom GR-Immuno-Pellet zu lösen, und geben Sie 355 Mikroliter TEG-Puffer sowie 45 Mikroliter fünf Molar Natriumchlorid zum Antikörper. PAS-Pellet zuvor hergestellt.

Die Proben auf ein vertikales rotierendes Rad geben und eineinhalb Stunden unter konstanter Rotation inkubieren. Die nicht gebundenen Proteine aus dem Immuno-Pellet durch Zentrifugation für eine Minute bei 10.000 Gs entfernen. Die Pellets einmal mit einem Milliliter TEG-Puffer und einmal mit einem Milliliter 10 Millimolar HEPES-Puffer, pH 7,4, waschen. Unter Verwendung einer abgeknickten P-200-Pipettenspitze die Waschpufferlösung entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, das Pellet nicht aufzuwirbeln.

Um den GR HSB 90 Heterokomplex wiederherzustellen, geben Sie zum Pellet eine Mischung bestehend aus 50 Mikrolitern einer Quelle für molekulare Chaperone, wie beispielsweise einem Kaninchen-Reticulozyten-Lysat, und fünf Mikrolitern eines ATP-Generierungssystems hinzu. Dieser nächste Schritt ist entscheidend, um eine ausreichende Vermischung des Pellets mit der Rekonstitutionslösung sicherzustellen. Inkubieren Sie die Proben genau 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius.

Tippen Sie alle ein bis zwei Minuten leicht auf die Röhrchen, um das Pellet vorsichtig aufzulösen und die Rekonstitutionslösung zu mischen. Geben Sie ein Milliliter TEGM-Puffer hinzu, wirbeln Sie die Probe kurz auf und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 10.000 G. Entfernen Sie das Überstandsvolumen, wobei darauf geachtet werden muss, das Pellet nicht zu stören.

Wiederholen Sie die Waschung zwei weitere Male, um Proteine im rekonstituierten Pellet nachzuweisen. Bereiten Sie die Proben für die Elektrophorese vor, indem Sie 50 Mikroliter SDS-PAGE-Probenpuffer, der Beta-Mercaptoethanol enthält, hinzufügen. Vortexen Sie die Proben und inkubieren Sie sie dann fünf Minuten lang in einem siedenden Wasserbad oder einem elektronischen Heizblock bei 100 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 Gs für eine Minute. Verwenden Sie das Überstand aus diesen Proben für SDS-Page oder mikrofluidische Elektrophorese, gefolgt von Western Blot. Die Verwendung einer P-200-Kapillare mit abgeflachter Spitze zum Beladen des Überstandes verringert das Risiko einer versehentlichen Aufnahme des Pellets.

Der nächste Schritt besteht darin, den GR-HSP-90-Proteinkomplex auf Steroidbindungsaktivität zu untersuchen. Geben Sie unter Verwendung eines tritiierten Steroids zunächst 47,5 µL HEM-Puffer und 2,5 µL zweimikromolares tritiiertes Dexamethason zum rekonstituierten Immuno-Pellet hinzu.

Vorsichtig den Pellet mischen, wobei darauf geachtet werden sollte, die Menge der Probe, die an die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens verdrängt wird, zu minimieren. Die Probe über Nacht ungestört auf Eis inkubieren. Vorsichtig ein Milliliter TEGM-Puffer hinzufügen, mischen und eine Minute bei 10.000 ×g zentrifugieren.

Entfernen Sie das Überstandsvolumen mit Bedacht. Es enthält ungebundenes tritiiertes Steroid. Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal mit TEGM-Puffer. Entfernen Sie am Ende der letzten Waschung vollständig den Überstand.

Unter Verwendung einer angerauten P-200-Pipettenspitze. Die gewaschenen Immuno-Pellets in 200 Mikrolitern TEGM-Puffer suspendieren und in 10 Milliliter Szintillationsfläschchen überführen.

Geben Sie 4,8 Milliliter Szintillationscocktail in die Gefäße und wirbeln Sie diese. Führen Sie abschließend eine Flüssigkeits-Zählung mittels Szintillationszählung durch. Repräsentative SDS-Page- und Western-Blot-Daten sind hier in diesem Kumasi-Färbegel dargestellt. Der endogene GR-Hsp90-Heterokomplex wird aus dem zellulären Zytosol unter Verwendung von anti-GR-Antikörpern immunpräzipitiert, und die individuellen Proteine, die mit dem GR mitpräzipitiert wurden, werden sichtbar gemacht und dargestellt.

Hier sind Experian-Mikrofluidik-Elektrophorese-Daten, die rekonstituierte GR-HSP-90-Heterokomplexe darstellen. Die Spezifität der GR-Immunoabsorption wird bestätigt, indem der immunoabsorbierende anti-GR-Antikörper durch einen nicht-immunen Antikörper ersetzt wird, selbst wenn überschüssige Mengen verwendet werden. Weder GR noch molekulare Chaperone werden immunpräzipitiert.

Ebenso lässt sich die Dissoziation von HSP 90 und anderen Chaperonproteinen vom salzbehandelten GR durch Western Blot der abgespülten und rekonstituierten Immunkomplexe bestätigen. Die schwere Kette des immunadsorbierenden Antikörpers ist sowohl durch Kumasi-Färbung als auch durch Western Blot nachweisbar und bestätigt, dass in jeder Spur Immunkomplexe gleicher Größe dargestellt werden. Hier sind repräsentative Daten zur steroidbindenden Aktivität des immunadsorptiven GR unter Verwendung entweder von Reticulozytenlysaten oder gereinigten Proteinen dargestellt.

Die Steroidbindungsaktivität des rekonstituierten GR-HSP90-Heterokomplexes liegt typischerweise bei 75 bis 100 % der endogenen GR-HSP90-Bindungsaktivität. Ähnlich wie bei den Elektrophorese-Daten kann ein nicht-immunes Antikörper als negativer Kontrollwert und als Maß für unspezifische tritiierte Steroidbindung anstelle des anti-GR-Antikörpers verwendet werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die 2D-Gelelektrophorese durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss posttranslationale Modifikationen von HSP90 auf die Rekonstitution des Heterokomplexes und die Steroidbindung haben. Rekonstitutionsassays wie die hier beschriebenen haben es Forschern ermöglicht, die funktionelle Bedeutung der auf HSP90 und HSP70 basierenden MultiPro-Chaperonmaschinerie sowie deren schrittweise Assemblierung unter Verwendung des Glucocorticoidrezeptors als Modell-HSP90-Klientprotein zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man funktionelle Glukokortikoidrezeptor-HSP-90-Proteinkomplexe aus gereinigten Proteinen in zellulären Lysaten herstellt. Die verwendeten Schritte umfassen die Herstellung eines GR-haltigen zellulären Lysats, die immunpräzipitative Gewinnung des Rezeptors, das Entfernen der endogenen Proteine durch Salzwäsche sowie die Rekonstitution des heterogenen Komplexes unter Verwendung von exogenem HSP-90, HSP-70-Kofaktoren und weiteren Chaperonen.