Automatisierte Hydrophobe Interaktions-Chromatographie Spaltenauswahl für den Einsatz in Protein Purification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine optimale HI-Flüssigkeitschromatographiesäule mithilfe eines automatisierten Abklärungsverfahrens zur Reinigung eines rekombinanten Proteins mit einem BioRad-DUO-Flow-Medium-Druck-Flüssigkeitschromatographiesystem auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zunächst die erforderlichen Puffer und bakteriellen Lysate, die das gewünschte rekombinante Protein enthalten, hergestellt werden. Anschließend wird das Duo-Flow-Chromatographiesystem physisch aufgebaut, angeschlossen und für das Abklärungsprotokoll vorbereitet.

Anschließend werden die Proben aufgeladen und die programmierte HI-Säulen-Scouting-Methode durchgeführt, um die Fraktionsprobe eit zu sammeln. Schließlich wird die EIT analysiert und die optimale HI-Säule sowie das geeignete Medium anhand der beobachteten Trenncharakteristika identifiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein bevorzugtes HI-Säulenmedium für die Hochskalierung der Reinigung des Proteins der Untersuchungsperson mittels Flüssigkeitschromatographie mit mittlerem Druck unter Verwendung der automatisierten HI-Säulen-Scouting-Funktionen von DUO flow zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie aufeinanderfolgenden manuellen Säulenchromatographieläufen besteht darin, dass die Automatisierung des Prozesses die Variabilität verringert und hochgradig reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der physikalischen Komplexität moderner Flüssigkeits-Chromatographie-Systeme Schwierigkeiten haben. Dies lässt sich jedoch leicht bewältigen.

Nach ausreichender Übung werden Orange Stone und Shelly Anderson, zwei Studenten aus meinem Labor, die Durchführung des Verfahrens demonstrieren. Zunächst bereiten Sie 500 Milliliter der folgenden Pufferlösungen vor: 200 Millimolar Natriumphosphat als Puffer A1, 200 Millimolar Natriumhydrogenphosphat als Puffer A2 sowie 4,8 Molares Ammoniumsulfat. Für Puffer B2 dient entionisiertes Wasser als Puffer B1. Entgasen Sie die Puffer, um optimale chromatographische Betriebsbedingungen sicherzustellen. Das System Maximizer mischt die Puffer A1 und A2, um einen phosphathaltigen Elutionspuffer mit niedrigem Salzgehalt zu erzeugen, und kombiniert die Puffer B1 und B2, um den Ammoniumsulfat-Puffer mit hohem Salzgehalt herzustellen.

Startpuffer. Bereiten Sie 20 Milliliter der zu beladenden Probe vor, indem Sie 10 Milliliter Zelllysat, das das zu reinigende Protein enthält, mit 10 Millilitern Puffer B zwei mischen. Die endgültige Ammoniumsulfatkonzentration der Zelllysatlösung sollte etwa 2,4 molare betragen, was annähernd der des Startpuffers entspricht.

Filtrieren Sie die Lysatpuffermischung durch einen niederbindenden 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter, um Partikel aus der Lösung zu entfernen. Bewahren Sie die Probe bis zur Beladung des Systems auf Eis auf. Der physikalische Aufbau und die Verrohrung des Chromatographiesystems gehören zu den kompliziertesten Aspekten dieses Verfahrens.

Richten Sie das Duo-Flow-Chromatographiesystem gemäß dem hier gezeigten Diagramm ein. Stellen Sie sicher, dass ausreichende Puffermengen für den gesamten Protokollablauf vorhanden sind und dass die Schläuche weiterhin untergetaucht bleiben. Verlegen Sie das Probenzulaufventil und die dynamische Probenschleife wie hier dargestellt und verbinden Sie die Probenschleife mit dem Eingang des Probenventils an Position drei.

Bereiten Sie acht identisch große Paare aus Peak-Tubing mit einem Außendurchmesser von einem Sechzehntel Zoll vor. Verbinden Sie anschließend die Paare mit den Positionen eins bis acht der beiden Säulenauswahlventile. Schalten Sie danach die UV-Detektorlampen ein, stellen Sie sicher, dass alle Detektoren kalibriert sind, und befestigen Sie das Strahlteilerventil des Fraktionssammlers sowie den Splitter-Controller, wie hier dargestellt.

Das Spaltventil des Fraktionssammlers an Position zwei und der Spaltregler werden außerhalb der Chromatographie-Workstation betrieben. Stellen Sie die Spaltmenge auf 10 % ein. Ersetzen Sie den Standard-Tropfenaufsatz des Fraktionssammlers an Position zwei durch einen Mikroplatten-Tropfenaufsatz.

Spülen Sie die Proben-Schleife und reinigen Sie das Chromatographiesystem. Starten Sie dann einen manuellen Fluss von einem Milliliter pro Minute Evolutionspuffer durch das System. Schließen Sie 1 ml High-Trap-HI-Säulen an die Positionen zwei bis acht der Säulenauswahlventile an.

Entfernen Sie die Verbindung, die die Kolonnenauswahlventile der Position zwei verbindet. Befestigen Sie die oberstromigen Kolonnenanschlüsse am Duo-Flow. Leiten Sie den Elutionspuffer durch die Anschlüsse, bis sämtliche Luft ausgetrieben ist und ein großer Tropfen Puffer sichtbar ist.

Entfernen Sie anschließend den Verschluss, der mit dem Säuleneinlass verbunden ist, und geben Sie einen großen Tropfen Puffer mit niedriger Ionenstärke auf die Oberseite der Säule. Schließen Sie dann die Säule an die oberstrom gelegenen Anschlüsse an. Verbinden Sie den Auslass mit den unterstrom gelegenen Säulenanschlüssen und dem Schlauch des Umschaltventils.

Stellen Sie den Gegendruckbegrenzer auf 40 PS.I ein. Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina. Pufferpuffer mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute. Waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina Startpuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.

Nachdem sich die pH-UV-Aufzeichnungen und der Gegendruck stabilisiert haben, schalten Sie die Säulenauswahlventile manuell auf Position eins und stoppen Sie den Pufferfluss. Um eine Probe aufzuladen, tauchen Sie das Probeneinlassrohr in die 20 Milliliter Probe ein. Schalten Sie dann das Ventil für das Beladen und Waschen der Probenschleife auf Position eins und das Probenaufgabeventil auf Spülen.

Aktivieren Sie die Probe-Schleifen-Ladepumpe, um die Probe bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute in die Pumpenschläuche einzusaugen, und zwar bis unmittelbar nachdem die Probe das Probenzuführventil erreicht hat. Schalten Sie das Probenzuführventil von Spülen auf Laden um. Starten Sie die Probe-Schleifen-Ladepumpe erneut mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute, bis 10 Milliliter Probe aus dem Aufbaufenster der Biologic-Software in die dynamische Proben-Schleife gezogen wurden.

Wählen Sie die in dieser Tabelle mit einem Stern gekennzeichneten Systemgeräte aus. Danach wählen Sie sechs HIC-Säulen für das Assay-Programm aus. Ein linear absteigender Salzgradient und eine manuelle Sechs-Säulen-Scouting-Methode starten den Pufferfluss mit einer Milliliter pro Minute.

Drücken Sie die Starttaste am Splitter-Controller, um sofort nach dem Starten des Programmablaufs die Aufteilung des EIT-Stroms im Verhältnis 90 % zu 10 % einzuleiten. Drücken Sie anschließend die Starttaste auf dem Bildschirmsteuerfeld des Offline-96-Well-Platten-Fraktionssammlers. Beobachten Sie die Echtzeit-Anzeige, um die erwarteten Laufparameter zu bestätigen. Vergleichen Sie die GFP-spezifische Absorptionskurve bei 397 Nanometer mit der Absorptionskurve für Gesamtprotein bei 280 Nanometer, um die relative Trennung und Reinigung anhand der verschiedenen getesteten HI-Medien abzuschätzen. Aliquots von fünf bis 50 Mikrolitern aus den Fraktionen der 96-Well-Platte können in eine neue Platte übertragen und auf spezifischen Proteininhalt mittels ELISA oder Western Blot sowie auf Gesamtproteininhalt mittels SDS-PAGE oder einem Experion-Mikrofluidik-Elektrophorese-System analysiert werden. Repräsentative Leitfähigkeit des Salzgradienten und Säulendruck der Testläufe sind hier dargestellt.

Die Änderung der Salzkonzentration, gemessen als Prozentsatz des aus den Hochsalz-Pufferleitungen entnommenen Puffers, ist typisch für die HI-Methode. Wenn die Salzkonzentration abnimmt, eluieren Proteine, die an die Säule gebunden sind, entsprechend der Leitfähigkeit, wobei die beobachtete Salzkonzentration direkt nach den Quad-Tech- und UV-Detektoren inline gemessen wird. Die Verschiebung zwischen Salzgradient und Leitfähigkeitskurven zeigt die Zeit an, die der Puffer benötigt, um vom Pufferzulauf durch das System bis zum Leitfähigkeitsmonitor zu fließen.

Während des gesamten Probendurchlaufs bleiben der Systemdruck und der pH-Wert relativ konstant. Diese Abbildung zeigt Chromatogramme sequenzieller HI-Säulenscouting-Läufe mit inline-Detektion des Gesamtproteins. NGFP wird erreicht, indem die Lichtabsorption bei 280 Nanometern und 397 Nanometern gemessen wird.

Es ist möglich, die relative GFP-Menge und Trennung für jeden Scout-Run abzuschätzen. Durch den Vergleich der beiden Linien in dieser Abbildung wurden Kulturröhrchen der Fraktionen 10, 12, 14, 16 und 18 des Fenchel-FF-Scout-Runs unter normalem oder fluoreszierendem Raumlicht sowie unter UV-Licht sichtbar gemacht; die UV-Bilder wurden sowohl von vorne als auch von oben betrachtet, um das charakteristische GFP-Emissionsspektrum zu beobachten. GFP ist eindeutig in Fraktion 14 nachweisbar. In beiden UV-Aufnahmen ist das diffuse Blau im linken UV-Bild das von der UV-Lampe ausgehende Licht.

Diese Nachlaufdaten stimmen gut mit der Inline-Erkennung von GFP überein, die durch die Messung der Eluat-Absorption bei 397 Nanometern erfolgt und ebenfalls Fraktion 14 als enthaltend den Hauptpeak des eluierten GFP identifiziert. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blotting, ELISA, Rasterkraftmikroskopie und biochemische Rekonstitutionsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Reinheit und funktionellen Aktivität des gereinigten Proteins zu beantworten.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Notwendigkeit der manuellen Steuerung des Doppelflusssystems an mehreren Stellen der Methode zu beachten. Beispiele hierfür sind das Nachfüllen von Puffern und das Beladen von Proben, das Überprüfen auf Luftblasen sowie das Ein- und Ausschalten der Detektionslampen nach Bedarf. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ein Flüssigkeitschromatographiesystem verwendet wird, um automatisierte Scouting-Untersuchungen für optimale HI-Säulen und -Medien durchzuführen.

Die Inline- und Posteranalyse ermöglicht es einem Forscher, eine geeignete Säule für die nachfolgende Hochskalierung der Reinigung auszuwählen, die gegebenenfalls mit anderen chromatographischen Methoden kombiniert werden kann, um die Reinheit und Ausbeute des Zielproteins zu erhöhen.