Automatisierte Hydrophobe Interaktions-Chromatographie Spaltenauswahl für den Einsatz in Protein Purification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Auswahl einer optimalen HI-Flüssigkeitschromatographie-Säule unter Verwendung einer automatisierten Scouting-Methode für die Aufreinigung eines rekombinanten Proteins mit einem BioRad DUO flow Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographiesystem. Dies wird erreicht, indem zunächst die erforderlichen Puffer und bakteriellen Lysate hergestellt werden, die das rekombinante Protein von Interesse enthalten. Als nächstes wird das Duo-Flow-Chromatographie-System physisch eingerichtet, installiert und für das Scouting-Protokoll vorbereitet.

Dann werden die Proben geladen und die programmierte HI-Säulen-Scouting-Methode wird ausgeführt, um die Fraktionsprobe eit zu sammeln. Schließlich wird das EIT analysiert und die optimale Hi-Säule und das optimale Medium auf der Grundlage der beobachteten Trenneigenschaften identifiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein bevorzugtes HI-Säulenmedium für die hochskalierte Aufreinigung des interessierenden Proteins des Prüfarztes durch Mitteldruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung der automatisierten HI-Säulen-Scouting-Funktionen DUO flow zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie sequentiellen Läufen der manuellen Säulenchromatographie besteht darin, dass die Automatisierung des Prozesses die Variabilität verringert und hochgradig reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der physikalischen Komplexität moderner Flüssigkeitschromatographiesysteme Schwierigkeiten haben. Dies lässt sich jedoch ohne weiteres meistern.

Nach ausreichender Übung werden Orange Stone und Shelly Anderson, zwei Studenten aus meinem Labor, das Verfahren vorführen: Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter der folgenden Puffer vor: 200 Millimolar Natriumphosphat für den Puffer, A eins 200 Millimolar Natriumhydrogenphosphat für Puffer A zwei und 4,8 molare Ammoniumsulfate. Für Puffer B fungieren zwei deionisierte Wasser als Puffer B, einer entgast die Puffer, um optimale chromatographische Betriebsbedingungen zu gewährleisten. Der Systemmaximierer mischt die Puffer A eins und A zwei, um einen salzarmen Phosphat-Elutionspuffer zu erzeugen, und er mischt die Puffer B eins und B zwei, um das Ammoniumsulfat mit hohem Salzgehalt zu erzeugen.

Puffer starten. Bereiten Sie 20 Milliliter der zu ladenden Probe vor, indem 10 Milliliter Zelllysat, das das zu reinigende Protein enthält, mit 10 Millilitern Puffer B zwei gemischt werden. Die endgültige Ammoniumsulfatkonzentration der Zelllysat-Probenlösung sollte ungefähr 2,4 molar betragen, was in etwa dem Startpuffer entspricht.

Filtrieren Sie das Lysatpuffergemisch durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter mit geringer Proteinbindung, um Partikel aus der Lösung zu entfernen. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf, bis sie bereit ist, in das System geladen zu werden. Der physische Aufbau und die Installation des Chromatographiesystems ist einer der kompliziertesten Aspekte dieses Verfahrens.

Richten Sie das Duo-Flow-Chromatographie-System gemäß dem hier gezeigten Diagramm ein. Stellen Sie sicher, dass für das gesamte Protokoll ausreichende Mengen an Puffer zur Verfügung stehen und dass die Schläuche weiterhin unter Wasser bleiben. Loten Sie das Probenladeventil und die dynamische Probenschleife wie hier dargestellt aus und verbinden Sie die Probenschleife mit dem Einlass des Probenventils in Position drei.

Bereiten Sie acht identisch große Paare eines Peak-Rohrs mit einem Außendurchmesser von 16 Zoll vor. Verbinden Sie dann die Paare mit den Positionen eins bis acht der beiden Säulenwahlventile. Nachdem Sie die UV-Detektorlampen eingeschaltet und sich vergewissert haben, dass alle Detektoren kalibriert sind, bringen Sie das Strömungsteilerventil und den Splitterregler des Fraktionssammlers wie abgebildet an. Hier.

Die Position zwei, der Kollektor, das Splitterventil und der Splitterregler werden offline von der Chromatographie-Workstation betrieben. Legen Sie die prozentuale Aufteilung auf 10 fest. Ersetzen Sie den Standard-Fraktionssammlerkopf am Positionssammler mit zwei Fraktionen durch einen Mikrotiterplatten-Fallkopf.

Spülen Sie die Probenschleife und spülen Sie das Chromatographiesystem. Starten Sie dann einen manuellen Fluss von einem Milliliter pro Minute des Evolutionspuffers durch das System. Verbinden Sie einen Milliliter High-Trap-HI-Säulen mit den Positionen zwei bis acht der Säulenauswahlventile.

Entfernen Sie die Verschraubung, die die beiden Säulenwahlventile verbindet. Befestigen Sie die vorgeschalteten Säulenarmaturen an der Duo-Strömung. Lassen Sie den elucianischen Puffer durch die Armaturen laufen, bis die gesamte Luft ausgestoßen ist und ein großer Tropfen Puffer vorhanden ist.

Entfernen Sie als Nächstes den Stopfen, der mit dem Säuleneinlass verbunden ist, und geben Sie einen großen Tropfen salzarmen Puffer auf die Oberseite der Säule. Befestigen Sie dann die Säule an den vorgeschalteten Formstücken. Befestigen Sie den Auslass an den Armaturen der nachgeschalteten Säule und den Schläuchen des Auswahlventils.

Stellen Sie die Gegendruckgrenze auf 40 PS ein. Ich wasche die Spalte mit fünf Spaltenbänden. Evolutionspuffer mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina Startpuffer bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute.

Sobald sich der pH-Wert, die UV-Spuren und der Gegendruck stabilisiert haben, schalten Sie die Säulenauswahlventile manuell auf Position eins und stoppen den Pufferfluss. Um eine Probe zu laden, tauchen Sie den Probeneinlassschlauch in die 20-Milliliter-Probe. Schalten Sie dann das Waschventil der Probenschleife auf Position eins und das Probenladeventil auf Spülung.

Initiieren Sie die Aktion der Probenschleifenladepumpe, indem Sie die Probe mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute in den Pumpenschlauch aufsaugen, bis unmittelbar nachdem die Probe das Probenladeventil erreicht hat. Schalten Sie das Probenladeventil von Spül- auf Last. Starten Sie die Probenschleifenladepumpe mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute neu, bis 10 Milliliter Probe in die dynamische Probenschleife gezogen wurden. Aus dem Setup-Fenster der biologischen Software.

Wählen Sie in dieser Tabelle die mit einem Sternchen gekennzeichneten Systemgeräte aus. Wählen Sie als Nächstes sechs HIC-Säulen für das Assay-Programm aus. Ein linear absteigender Salzgradient und eine Sechs-Spalten-Scouting-Methode starten den Startpufferfluss manuell bei einem Milliliter pro Minute.

Drücken Sie Start auf dem Splitter-Controller, um die Aufteilung des 90%- bis 10%EIT-Stroms sofort nach dem Start der Programmmethode zu starten. Drücken Sie Start auf dem Bedienfeld auf dem Bildschirm des Offline-96-Well-Plattenfraktionssammlers. Beobachten Sie die Echtzeitanzeige, um die erwarteten Laufparameter zu bestätigen. Vergleichen Sie die GFP-spezifische 397-Nanometer-Absorptionsverfolgung mit der allgemeinen Protein-280-Nanometer-Absorptionsverfolgung, um die relative Trennung und Reinigung unter Verwendung der verschiedenen HI-Medien abzuschätzen, die ausgekundschaftet werden: Aliquoten von fünf bis 50 Mikrolitern aus den 96-Well-Plattenfraktionen können auf eine frische Platte übertragen und mittels Eliza- oder Western-Blot auf spezifischen Proteingehalt und Gesamtproteingehalt mittels SDS-Seite oder einem Experian mikrofluidischen Elektrophoresesystem untersucht werden. Hier sind die Gradientenleitfähigkeit und der Säulendruck der Erkundungsläufe dargestellt.

Die Änderung der Salzkonzentration, gemessen an dem Prozentsatz des Puffers, der aus Pufferlinien mit hohem Salzgehalt entnommen wird, ist typisch für die HI-Methodik. Wenn die Salzkonzentration die an die Säule gebundenen Proteine abnimmt, was der beobachteten entspricht, wird die Salzkonzentration unmittelbar nach den Quad-Tech- und UV-Detektoren gemessen. Der Versatz zwischen Salzgradienten und Leitfähigkeitsspuren gibt die Zeit an, die der Puffer benötigt, um vom Puffereinlass durch das System zum Leitfähigkeitswächter zu gelangen.

Während des gesamten Probenlaufs bleiben der Systemdruck und der pH-Wert relativ konstant. Diese Abbildung zeigt Chromatogramme des sequentiellen HI-Säulen-Scoutings, des Inline-Nachweises des Gesamtproteins. NGFP wird durch Messung der Absorption von Licht bei 280 Nanometern bzw. 397 Nanometern erreicht.

Es ist möglich, die relative GFP-Abundanz und den Abstand für jeden Erkundungslauf zu approximieren. Durch den Vergleich der beiden Linien in dieser Abbildung wurden die Kulturröhren für die Fraktionen 10, 12, 14, 16 und 18 des Fenchel-FF-Scouting-Laufs unter Umgebungs- oder Fluoreszenzlicht visualisiert, und die ultravioletten Lichtröhren wurden sowohl mit der Vorderseite nach vorne als auch von oben nach unten betrachtet, um das charakteristische GFP-Emissionsspektrum zu beobachten, GFP wird eindeutig in Fraktion 14 nachgewiesen. In beiden UV-Bildern ist das diffuse Blau im linken UV-Panel das Licht, das von der UV-Lampe ausgestrahlt wird.

Diese Post-Run-Daten stimmen gut mit der Inline-Detektion von GFP überein, indem sie die Eluidenabsorption bei 397 Nanometern messen, wodurch auch die Fraktion 14 als der Hauptpeak des angedeuteten GFP identifiziert wird. Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie Western Blotting, Eliza's, Rasterkraftmikroskopie und biochemische Rekonstitutionsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Reinheit und funktionellen Aktivität des zu reinigenden Proteins zu beantworten.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die Notwendigkeit einer manuellen Steuerung des Dual-Flow-Systems an mehreren Stellen der Methode zu erinnern. Beispiele hierfür sind das Nachfüllen von Puffern und das Laden von Proben, die Überprüfung auf Luftblasen und das Ein- und Ausschalten von Detektionslampen bei Bedarf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Flüssigkeitschromatographiesystem verwenden, um automatisiertes Scouting nach optimalen HI-Säulen und -Medien durchzuführen.

Die Inline- und Poster-evaluierte Analyse ermöglicht es einem Forscher, eine geeignete Säule für die anschließende Scale-up-Aufreinigung auszuwählen, die auch mit anderen chromatographischen Methoden kombiniert werden kann, um die Reinheit und Ausbeute des Zielproteins zu erhöhen.