Markierung von murinen T-Helper-Lymphozyten mit radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern

Zur radioaktiven Markierung von murinen T-Helfern, Th-Lymphozyten, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) tragen, der spezifisch für Hühner-Ovalbumin-Peptid ist, wird ein Röhrchen mit radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern, mAbs, mit der gewünschten radioaktiven Aktivität entnommen.

Der mAb besteht aus einem murinen mAb, der spezifisch für den TCR ist, der auf der murinen Th-Lymphozytenmembran exprimiert wird. Ein Chelator konjugiert das mAb und ein Positronen-emittierendes Kupferisotop und bildet einen stabilen Komplex.

Verdünnen Sie die radioaktiv markierten mAbs mit Kochsalzlösung. Als nächstes geben Sie die verdünnten radioaktiv markierten mAbs in eine Multiwell-Platte, die eine Th-Lymphozytensuspension enthält. Kurz inkubieren.

Innerhalb der Kultur binden die radioaktiv markierten mAbs an die TCRs auf den Th-Lymphozytenmembranen. Übertragen Sie die Zellsuspension nach der Inkubation in ein frisches Röhrchen.

Zentrifuge. Der Überstand mit ungebundenen, radioaktiv markierten Antikörpern ist zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Th-Lymphozyten in Medium und überführen Sie sie in eine Multiwell-Platte. Inkubieren Sie für eine längere Dauer.

Die radioaktiv markierte mAb-TCR-Bindung bewirkt die Rekrutierung von Adapterproteinen an die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran, an die Clathrin-Triskelionen binden und eine Clathrin-beschichtete Grube bilden.

Akzessorische Proteine helfen dabei, das Vesikel von der Plasmamembran abzuklemmen und erleichtern so die Internalisierung des radioaktiv markierten mAb-TCR-Komplexes in das Zytoplasma. Schließlich werden TCRs auf den Th-Lymphozytenmembranen wieder exprimiert.

Die radioaktiv markierten Th-Lymphozyten sind bereit für weitere Experimente.

Für die Ovaalbumin-spezifische TH1-Zellmarkierung von Hühnern wird zunächst ein Dosiskalibrator verwendet, um 37 Megabecquerel des interessierenden T-Zell-spezifischen radioaktiven Antikörpers in eine Spritze ohne Totvolumen zu ziehen.

Geben Sie anschließend den Antikörper in einen Reaktionsbecher und messen Sie die verbleibende Menge an Reaktivität in der Spritze und subtrahieren Sie von der Menge, die entnommen wurde. Geben Sie dann einen Milliliter Kochsalzlösung in den Becher, um eine Lösung mit 37 Megabecquerel pro Milliliter zu erhalten.

Als nächstes fügen Sie zweimal 10 zu den sechsten OVA-TH1-Zellen in 0,5 ml vollständigem Medium in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte hinzu, gefolgt von 20 Mikrolitern der radioaktiv markierten Antikörperlösung. Nach 30 Minuten in einem strahlensicheren Inkubator mit 37 Grad Celsius und 7,5 % Kohlendioxid werden die radioaktiv markierten Zellen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen für zwei Wäschen in 10 Millilitern 37 Grad Celsius PBS gepoolt.