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Immunologie
0 Aufrufe • 3:52 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie anästhesierte Wildtyp- und Dicer-2-mutierte männliche Drosophila auf einer Injektionsschale unter einem Stereomikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Fliegen frei von symbiotischen Bakterien sind, die die Replikation von RNA-Viren unterdrücken.
Impfen Sie die Fliegen intrathorakal mit einem Nanoinjektor, der eine einzelsträngige RNA-Virussuspension mit positivem Sinn enthält.
Das Virus dringt über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Wirtszelle ein und repliziert sich unter Bildung doppelsträngiger intermediärer RNA. Der Wirtsmustererkennungsrezeptor Dicer-2 verarbeitet die virale doppelsträngige RNA zu kleinen interferierenden RNAs, siRNAs.
Die siRNA bindet an den RNA-induzierten Silencing-Komplex RISC, wo ihr komplementärer Strang entfernt wird. Die RISC-geladenen siRNAs binden über komplementäre Basenpaarung an andere virale RNAs, was zu einem Abbau viraler RNA und Gen-Silencing führt.
Die Interaktion zwischen Dicer-2 und viraler RNA aktiviert nachgeschaltete antivirale Signalkaskaden und produziert antivirale Proteine. Diese antiviralen Proteine interagieren mit den Januskinase (JAK) der benachbarten Wirtszellen und initiieren so die Rezeptordimerisierung und die JAK-Phosphorylierung.
Aktivierte JAKs phosphorylieren und aktivieren STAT-Proteine, einen Signalwandler und Transkriptionsaktivator. Aktivierte STATs translozieren in den Zellkern und binden an spezifische DNA-Sequenzen, wodurch die Transkription von Genen für antivirale Reaktionen eingeleitet wird.
Züchten Sie die Fliegen für einen gewünschten Zeitraum.
Nachgelagerte Analysen deuten auf eine verringerte Überlebensrate und eine erhöhte Viruslast bei Dicer-2-mutierten Fliegen hin.
Bei einer Virusinfektion verwenden Sie zunächst ein Stereomikroskop und eine dünne Pinzette, um die Spitze einer Glaskapillarnadel auf den für die Nanoinjektion geeigneten Durchmesser zu brechen. Um den Injektor zu montieren, setzen Sie den Dichtungs-O-Ring und einen weißen Abstandshalter mit dem großen Grübchen nach außen auf den Metallkolben des Injektors.
Füllen Sie die Glasnadel mit einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel mit Mineralöl und führen Sie die Nadel durch den Kragen. Platzieren Sie den größeren O-Ring etwa 1 Millimeter vom stumpfen Ende der Nadel entfernt um die Basis des Kragens und montieren Sie die Nadel auf den Kolben des Injektors.
Befestigen Sie die Nadel am Kolben und drücken Sie die leere Taste, um den Kolben des Mikroinjektors auszufahren, bis ein akustisches Signal zu hören ist. Drücken Sie nun Füllen, um den Kolben 5 Millimeter zurückzuziehen, und tauchen Sie die Nadel in eine Virussuspension mit 100 Plaque-bildenden Einheiten. Schütteln Sie eine oder mindestens drei Durchstechflaschen mit 20 Wolbachia-freien männlichen Drosophila vorsichtig in die Injektionsschale.
Männliche Fliegen werden bevorzugt, da die hormonelle Variation während der Paarung und Fortpflanzung die Auslesung bei Weibchen beeinflussen kann.
Injizieren Sie dann 50,6 Nanoliter Viruslösung in den Thorax jeder Fliege in die etwas hellere Region zwischen der Mesopleura und der Tetrapleura und messen Sie die DCV-Last mit dem zytopathischen Effektassay und der quantitativen RT-PCR von Bodenfliegen, wie gerade gezeigt. Übertragen Sie die Fliegen nach der Injektion vorsichtig in ein frisches Fläschchen und platzieren Sie das Fläschchen in einer horizontalen Position, um zu verhindern, dass die Fliegen am Medium kleben, während sie sich von der Narkose erholen.