Bestimmung der ROS-Produktion durch Neutrophile bei Wechselwirkung mit opsonisiertem Biofilm

Bakterien, die mit Opsoninen markiert sind, werden durch spezifische Neutrophilenrezeptoren erkannt, die die Phagozytose mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Freisetzung und den bakteriellen Abbau auslösen.

Um die ROS-Produktion durch Neutrophile in vitro zu quantifizieren, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte. Die Testvertiefung enthält einen Staphylococcus aureus-Biofilm, der aus in extrazelluläre Matrixfilme eingebetteten Bakterien besteht. Die Kontrollvertiefung ist ohne Biofilm.

Inkubieren Sie den Biofilm mit menschlichem Serum, so dass Serum-Opsonine den Biofilm opsonisieren können.

Aspirieren Sie das Serum. Mit Puffer waschen und dabei ungebundene Opsonine entfernen. Fügen Sie Neutrophile und Luminol hinzu – eine chemilumineszierende Verbindung zu den Vertiefungen. Zentrifuge, die die Neutrophilen in die Nähe des Biofilms bringt.

Messen Sie mit einem Plattenleser die Lumineszenz über die Zeit.

In der Vertiefung, die den Biofilm enthält, binden Neutrophile an die Opsonine des Biofilms, was zur Aktivierung der Neutrophilen und zur bakteriellen Internalisierung in Phagosomen führt. Spezifische Signalwege werden aktiviert, was zu einer NADPH-Oxidase-Assemblierung an Phagosome