Bestimmung der ROS-Produktion durch Neutrophile bei Wechselwirkung mit opsonisiertem Biofilm
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:47 Min. • July 8th, 2025
Bakterien, die mit Opsoninen markiert sind, werden durch spezifische Neutrophilenrezeptoren erkannt, die die Phagozytose mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Freisetzung und den bakteriellen Abbau auslösen.
Um die ROS-Produktion durch Neutrophile in vitro zu quantifizieren, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte. Die Testvertiefung enthält einen Staphylococcus aureus-Biofilm, der aus in extrazelluläre Matrixfilme eingebetteten Bakterien besteht. Die Kontrollvertiefung ist ohne Biofilm.
Inkubieren Sie den Biofilm mit menschlichem Serum, so dass Serum-Opsonine den Biofilm opsonisieren können.
Aspirieren Sie das Serum. Mit Puffer waschen und dabei ungebundene Opsonine entfernen. Fügen Sie Neutrophile und Luminol hinzu – eine chemilumineszierende Verbindung zu den Vertiefungen. Zentrifuge, die die Neutrophilen in die Nähe des Biofilms bringt.
Messen Sie mit einem Plattenleser die Lumineszenz über die Zeit.
In der Vertiefung, die den Biofilm enthält, binden Neutrophile an die Opsonine des Biofilms, was zur Aktivierung der Neutrophilen und zur bakteriellen Internalisierung in Phagosomen führt. Spezifische Signalwege werden aktiviert, was zu einer NADPH-Oxidase-Assemblierung an Phagosomen führt.
NADPH-Oxidase katalysiert den Elektronentransfer von NADPH zu molekularem Sauerstoff und erzeugt ROS, die Bakterien abbauen. Darüber hinaus setzt die NADPH-Oxidase auf der Zellmembran extrazellulär ROS frei.
Als Reaktion darauf produzieren Biofilmbakterien Enzyme, die ROS neutralisieren und Leukocidine freisetzen, die Poren in neutrophilen Membranen bilden und eine Lyse verursachen, wodurch die ROS-Produktion gestört wird. Luminol reagiert mit ROS, verursacht dessen Anregung und emittiert bei Entspannung Lumineszenz.
Die Testvertiefung wies im Vergleich zur Kontrolle erhöhte ROS-Spiegel auf, was auf neutrophil-opsonisierte Biofilm-Wechselwirkungen hinweist.
Geben Sie 100 Mikroliter 20 % normales Humanserum, verdünnt in HBSS, tropfenweise, in den gewaschenen Biofilm und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um den Biofilm zu opsonisieren. Aspirieren Sie die Serumlösung und waschen Sie die Biofilme tropfenweise mit 150 Mikrolitern HBSS. Aspirieren Sie das HBSS und hinterlassen Sie Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen.
Fügen Sie Luminol zu den in HBSS resuspendierten Neutrophilen hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mikromolarem Luminol zu erhalten. Diese Lösung ist gebrauchsfertig für die Gruppen A und C. Fügen Sie mit Luminol gemischte Neutrophile zu den Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen hinzu.
Für Gruppe D bereiten Sie 50 mikromolare Luminollösung in HBSS in einem separaten Röhrchen ohne Neutrophile vor und geben Sie sie in die Vertiefung, die den Biofilm enthält. Aliquotieren Sie 350 Mikroliter Neutrophile, die mit Luminol gemischt sind, und fügen Sie PMA in einer Endkonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter zu der Mischung hinzu.
Für Gruppe B geben Sie die Neutrophilen aus diesem Gemisch in Vertiefungen ohne Biofilm. Dies dient als Positivkontrolle. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 RCF für 30 Sekunden bei 4 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass der Plattenleser auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, die Lumineszenz und die kinetische Messung 60 Minuten lang in 3-Minuten-Intervallen.
Legen Sie die Platte in den Plattenleser, um die ROS-Produktion durch Neutrophile 60 Minuten lang zu messen.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Interaktion zwischen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen unter besonderer Berücksichtigung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Die Methodik umfasst die Opsonisierung der Biofilme und die Quantifizierung von ROS mittels Luminol in einem Mehrlochplatten-Setup.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Neutrophile spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen bakterielle Infektionen.
- Die Opsonisierung verbessert die Erkennung von Krankheitserregern durch Immunzellen.
- Reaktive Sauerstoffspezies sind wichtig für den bakteriellen Abbau.
- Biofilme stellen besondere Herausforderungen für die Immunantwort dar.
Zweck der Studie
- Quantifizierung der ROS-Produktion durch Neutrophile als Reaktion auf opsonisierte Staphylococcus aureus-Biofilme.
- Verständnis der Mechanismen der Neutrophilenaktivierung und bakteriellen Internalisierung.
- Untersuchung der an der ROS-Generierung beteiligten Signalwege.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Biofilmen und Opsonierung mit humanem Serum.
- Inkubation von Neutrophilen mit Luminol zur Messung der Lumineszenz.
- Verwendung eines Plattenlesegeräts zur Quantifizierung der ROS-Produktion über die Zeit.
- Vergleich von Testansätzen mit Biofilmen und Kontrollansätzen ohne Biofilme.
Hauptergebnisse
- Erhöhte ROS-Spiegel wurden in Wells mit opsonisierten Biofilmen beobachtet.
- Neutrophile, die durch Opsonine aktiviert wurden, zeigten eine verbesserte bakterielle Internalisierung.
- Bestimmte Signalwege wurden als entscheidend für die Assembly der NADPH-Oxidase identifiziert.
- Biofilmbakterien zeigten Mechanismen zur Neutralisierung von ROS und zur Umgehung neutrophiler Antworten.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstreicht die Bedeutung der Opsonisierung bei der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilmen.
- Das Verständnis der ROS-Produktion kann therapeutische Strategien gegen biofilmassoziierte Infektionen maßgeblich beeinflussen.
- Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um das Gleichgewicht zwischen Neutrophilen-Aktivierung und bakterieller Evasion zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Test ermöglicht die quantitative Messung der von Neutrophilen vermittelten ROS-Produktion als Reaktion auf opsonisierte Biofilme und liefert damit einen funktionellen Endpunkt für die Aktivität immunvermittelter Effektoren. Er unterstützt die Zielvalidierung in der antiinfektiösen Wirkstoffforschung, indem er die opsonisierungsabhängige Phagozytose mit der Kinetik des oxidativen Bursts verknüpft. Die Methode hilft, mechanistische Risiken bei immunmodulatorischen Kandidaten abzubauen, die darauf abzielen, die Penetration der Neutrophilen in Biofilme zu verbessern oder der bakteriellen ROS-Vermeidung entgegenzuwirken.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die funktionelle Neutrophilenaktivierung über die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) nach Bindung an opsonisierte Biofilme.
- Praktischer Wert: Nutzt luminolbasierte Chemilumineszenz zur echtzeitfähigen, quantitativen Detektion von ROS in einem Mehrbrunnenformat.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterscheidet spezifische, opsoninabhängige Reaktionen von der Grundaktivität der Neutrophilen durch Verwendung opsoninfreier Kontrollen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt dosisabhängige Lumineszenzsignale, die proportional zum ROS-Fluss sind, und ermöglicht so die Profilierung von Substanzeffekten.
- Operativer Wert: Standardisiert die Vorbereitung von Biofilmen, die Opsonierung und die Inkubation von Neutrophilen in verschiedenen Vertiefungen für reproduzierbare Messwerte.
- Wissenschaftlicher Wert: Erkennt Hemmung oder Steigerung der ROS-Produktion und unterstützt dadurch die Identifizierung von Hits in Screenings für Immunmodulatoren oder antibiofilmwirksame Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und Biofilmen in einem physiologisch relevanten in vitro-System.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Bewertung von Therapeutikakandidaten hinsichtlich sowohl der oxidativen Funktion von Neutrophilen als auch bakterieller ROS-Abwehrmechanismen.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die Mechanismen NADPH-Oxidase-abhängiger Signalwege, die für die Eliminierung von Krankheitserregern entscheidend sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für frühe Immunologie-Entdeckungsworkflows und folgt auf die Target-Engagement-Screening-Phase, vor der funktionellen Validierung in krankheitsrelevanten Infektionsmodellen.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft die Hypothese, dass Opsonisierung den oxidativen Burst von Neutrophilen gegen in Biofilmen eingebettete Krankheitserreger verstärkt.
- Screening: Ermöglicht die hochauflösende kinetische Profilierung der ROS-Produktion, um Testsubstanzen mit Fahrzeugkontrollen zu vergleichen.
- Analytik: Gibt die Lumineszenzintensität über die Zeit aus und quantifiziert die Fläche unter der Kurve als Maß für die kumulative ROS-Reaktion.
- Translationale Forschung: Verbindet funktionelle Assays der angeborenen Immunität mit präklinischen Modellen biofilmassoziiierter Infektionen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an andere Pathogen-Biofilm-Systeme oder Neutrophilenquellen für immunologische Screenings über verschiedene Forschungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert mechanistische Sicherheit hinsichtlich der Effektorfunktion von Neutrophilen und reduziert damit Unklarheiten bezüglich der Wirkmechanismen von Immunmodulatoren.
- Operationaler Wert: Nutzt weit verbreitete Plattenlesegeräte-Technologie, wodurch ein dezentraler Einsatz an verschiedenen Forschungsstandorten ermöglicht wird.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die Zielmodulation mit der funktionalen Immunantwort in infektionsrelevanten Kontexten verknüpft wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die die Biofilmentfernung durch Neutrophile verbessern, ohne zu übermäßiger Aktivierung zu führen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Neutrophilen, der Kultur von Biofilmen und Opsonisierungsprotokollen.
- Benötigt einen auf Luminol kompatiblen Plattenreader mit kinetischer Lumineszenzmessung bei 37 °C.
- Setzt standardisierte Opsonisierungs- und Waschschritte mit Serum voraus, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
- Muss bei der Versuchsplanung die Spendervariabilität bezüglich der ROS-Produktionskapazität von Neutrophilen berücksichtigen.
- Auf in vitro-Systeme beschränkt; bildet weder die Biofilmarchitektur noch die Rekrutierung von Immunzellen in vivo ab.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026