Beurteilung der chemisch induzierten Kolitis durch immunhistochemische Analyse von Dickdarmgewebeschnitten

Bei Mäusen besteht die Dickdarmschleimhautschicht aus Immunzellen, die Lamina propria enthalten, umgeben von einem dicht gepackten Epithel, das die Schleimhaut schützt. Die chemische Behandlung mit Dextran-Natriumsulfat stört die Tight Junctions, was zu einer Schädigung der Epithelzellen führt und es luminalen Mikroben ermöglicht, in die Lamina propria einzudringen.

Die mikrobielle Erkennung im Dickdarm löst die Chemokinsekretion aus, was zur Infiltration von Immunzellen und zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt. Diese übertriebene Immunantwort führt zu einer Dickdarmentzündung oder Kolitis.

Um die chemisch induzierte Kolitis zu beurteilen, beginnen Sie mit einem Objektträger mit einem festen, vorbehandelten Dickdarmgewebeschnitt der Maus, der eine chemisch induzierte Kolitis aufweist. Behandeln Sie den Abschnitt mit einem Cocktail aus primären Antikörpern, die spezifisch für die Rezeptoren der Immunzellen sind, die an ihre jeweiligen Immunzellen binden.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Inkubieren Sie den Gewebeschnitt mit biotinylierten Sekundärantikörpern, die spezifisch an die Primärantikörper binden. Inkubieren Sie mit den Streptavidin-Enzym-Konjugaten, die mit Biotinen interagieren und Komplexe bilden.

Überlagern Sie den Gewebeschnitt mit einem chromogenen Substrat, die Enzym-Substrat-Wechselwirkung verleiht den Immunzellen eine braune Färbung. Färben Sie den Abschnitt mit Hämatoxylin-Farbstoff, um die Zellkerne zu färben.

Betrachten Sie den gefärbten Objektträger unter einem Mikroskop. Die Fülle an braunen Immunzellen im geschädigten Bereich deutet auf eine chemisch induzierte Kolitis hin.

Für die immunhistochemische Analyse waschen Sie die Objektträger nach dem 20-minütigen Erwärmen der Schnitte auf der Heizplatte dreimal 10 Minuten lang in PBS und eliminieren Sie die endogene Peroxidase mit einer 10-minütigen 3%igen Wasserstoffperoxid-Inkubation.

Am Ende der Inkubation werden die Proben wie gezeigt dreimal in PBS gewaschen und jede unspezifische Bindung mit Blockierungspuffer mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Ersetzen Sie dann den Blockierungspuffer durch den primären Antikörpercocktail von Interesse für eine Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Am nächsten Morgen aspirieren Sie die überschüssige primäre Antikörperlösung und waschen die Objektträger dreimal in PBS. Nach der letzten Wäsche inkubieren Sie die Objektträger mit dem entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörper-Cocktail und markieren Sie sie anschließend mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex bei Raumtemperatur.

Um die immunreaktiven Zellen sichtbar zu machen, markieren Sie die Proben mit DAB, bis sich eine hell- oder dunkelbraune Farbe entwickelt, und färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und 0,3 % verdünntem Ammoniak gegen.

Wenn die Objektträger getrocknet sind, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um Hellfeldbilder der Gewebeschnitte unter einer 10-fachen Vergrößerung zu erhalten, und verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm, um die Population der markierten Immunzellen sowohl im Epithel als auch in der Lamina propria zu identifizieren und zu quantifizieren.