Eine Technik zur Erzeugung von Influenzavirus-ähnlichen Partikeln über ein Säugetiersystem

Virusähnliche Partikel oder VLPs ahmen die Virusstruktur nach, aber es fehlt virales genetisches Material, wodurch sie nicht virulent sind. VLPs besitzen oberflächengebundene antigene Epitope, die von Immunzellen erkannt werden, was sie zu idealen Impfstoffkandidaten macht.

Um rekombinante Influenza-VLPs zu erzeugen, nehmen Sie eukaryotische Expressionsvektoren.

Zwei Vektoren enthalten Gene, die für Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) kodieren - Strukturproteine des Influenzavirus. Der dritte Vektor enthält das Gag-Gen, das für die Kernproteine des humanen Immundefizienzvirus kodiert.

Fügen Sie ein Transfektionsreagenz auf kationischer Lipidbasis hinzu. Die positiv geladene Lipidkopfgruppe interagiert mit negativ geladener DNA und bildet eine Doppelschicht um die Vektoren – wodurch Liposomen-Transfektionskomplexe entstehen.

Komplexe auf kultivierte Säugetier-Wirtszellen aufbringen, die für die VLP-Produktion geeignet sind, und inkubieren. Transfektionskomplexe gelangen durch Endozytose in die Zellen – die Liposomenmembran verschmilzt mit der Endosomenmembran, um die Vektoren in das Zytoplasma freizusetzen.

Vektoren dringen in den Zellkern ein und führen zur Expression der viralen Gene. Nach der HA- und NA-Synthese am endoplasmatischen Retikulum translozieren die Proteine über den sekretorischen Weg zur Plasmamembran.

Die Kernproteine werden im Zytoplasma synthetisiert und zum Assemblierungsort transportiert, um sich an der Plasmamembran zu verankern. Akkumulierte virale Komponenten organisieren sich selbst zu VLPs und knospen aus der Wirtszelle.

Ernten Sie die freigesetzten VLPs für die nachgelagerte Verarbeitung.

Bereiten Sie am Tag der Transfektion Liposomen- und DNA-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Die DNA-Zellen werden mit einer DNA-Zusammensetzung von 1:1:2 HA:NA:Gag und einer Gesamt-DNA-Menge von 40 Mikrogramm pro T-150-Kolben transfiziert. Wiederholen Sie diesen Schritt, um neun T-150-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 200 Millilitern herzustellen.

Anschließend werden die DNA- und Liposomenlösungen in serumfreien Transfektionsmedien ohne Antibiotika verdünnt, so dass jeder Kolben ein Gesamtvolumen von 24 Millilitern enthält. Setzen Sie die Kolben wieder in den Inkubator ein und bewahren Sie die Zellen bis zum Tag der virusähnlichen Partikel oder VLP und der Ernte in Transfektionskulturmedium auf.

Übertragen Sie den Überstand in konische 15-Milliliter-Röhrchen, um die Kultur 72 bis 96 Stunden nach der Transfektion aus den Zellen zu ernten. Schleudern Sie die Zellen nach unten, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Sammeln Sie die Überstände und filtern Sie sie durch eine 0,22-Mikron-Porenmembran.