Messung der in vivo Belastung durch Bakterien, die Luziferase exprimieren, in einer Insektenlarve

Um die bakterielle Belastung in vivo zu messen, beginnen Sie mit sterilisierten Insektenlarven, die mit Bacillus Calmette-Guérin oder BCG lux vorinfiziert sind.BCG lux ist ein genetisch veränderter Mycobacterium bovis BCG-Stamm, der Luciferase exprimiert – ein Biolumineszenz produzierendes Enzym.

Übertragen Sie eine Insektenlarve in ein pufferhaltiges Lysingmatrixröhrchen mit Stahlkugeln. Homogenisieren Sie die Larve mit einem Homogenisator und geben Sie die intrazellulären Bestandteile, einschließlich Bakterien, in den Puffer ab.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um das Homogenat aufzufangen und in ein Luminometerröhrchen zu übertragen.

Waschen Sie das Matrizenröhrchen mit einem reinigungsmittelhaltigen Puffer, um Zellfragmente zu lösen und verbleibende Bakterien freizusetzen.

Kombinieren Sie die Fraktionen in derselben Luminometerröhre und fügen Sie das Luciferase-Substrat hinzu. Substrate dringen in Bakterien ein und interagieren mit Luciferase-Enzymen, was zu Biolumineszenz führt. Laden Sie die Röhre in ein Luminometer und messen Sie die Biolumineszenz.

Das Luminometer misst die Intensität des emittierten Lichts und berechnet die relative Lichteinheit (RLU) – ein Hinweis auf die In-vivo-Belastung durch BCG in einer Insektenlarve.

Verteilen Sie die verdünnte Homogenatsuspension auf einer Piperacillin-haltigen Agarplatte und inkubieren Sie, um BCG selektiv als unterschiedliche Kolonien zu züchten. Die Kolonien auf der Platte stellen die koloniebildende Einheit (KBE) dar. Das Verhältnis von RLU zu CFU korreliert Biolumineszenz mit der Lebensfähigkeit von Bakterien.

Wählen Sie alle 24 Stunden nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus und verwenden Sie ein Wattestäbchen, das in 70 % Ethanol getränkt ist, um die Larvenoberflächen sanft zu sterilisieren. Die Larven werden einzeln in zwei Milliliter Lysingmatrixröhrchen mit 800 Mikrolitern sterilem PBS gegeben. Verwenden Sie dann einen Homogenisator, um die Larven 60 Sekunden lang bei sechs Metern pro Sekunde zu homogenisieren.

Zentrifugieren Sie die Lyseröhrchen fünf Sekunden lang bei 3.500 μm, um das Homogenat von den Deckeln zu entfernen, und dekantieren Sie das Homogenat vorsichtig einzeln in fünf sterile Luminometerröhrchen. Bewahren Sie 100 Mikroliter Homogenat in einem sterilen 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf. Das verbleibende Homogenat wird zurückgewonnen, indem die Lysingmatrixröhrchen mit einem Milliliter PBST gewaschen und in die entsprechenden Luminometerröhrchen pipettiert werden.

Drehen Sie die Luminometerröhren vor und messen Sie die Biolumineszenz der Homogenate auf einem Luminometer. Bereiten Sie dann 10-fache serielle Verdünnungen der reservierten 100 Mikroliter Homogenat in 24-Well-Kulturplatten mit PBST vor. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Verdünnung auf jede Middlebrook 7H11 Agarplatte und verwenden Sie einen sterilen Plattenspreizer zum Verteilen. Inkubieren Sie zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius.

Zählen Sie danach die koloniebildenden Einheiten.