Intraspinale Cell Transplantation für Targeting Cervical Vorderhorn in Amyotrophe Lateralsklerose und traumatische Rückenmarksverletzungen

Neuronale Vorläuferzellen der Transplantation ist eine vielversprechende Strategie für den Schutz und / oder Wiederbeschaffung verlorener / dysfunktional Gebärmutterhals phrenicus Motoneuronen im Rückenmark Verletzungen (SCI) und der Motor Neuron Erkrankung, amyotrophe seitlichen Sklerose (ALS). Wir bieten ein Protokoll für die Zelle Lieferung an zervikalen Rückenmarks Vorderhorn in Nagermodellen von ALS und Rückenmarksverletzungen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gezielte segmentale intraspinale Multis-Transplantation von neuralen Vorläuferzellen in das zervikale Rückenmark, die ventrale graue Substanz von Ratten und Mäusen. Dies wird erreicht, indem zunächst der interessierende neuronale Vorläuferzelltyp für die Transplantation vorbereitet wird. Dann wird an jedem Punkt der vorgesehenen Zelltransplantation eine Laminektomie am Rückenmark durchgeführt.

Anschließend werden die Zellen an den entsprechenden Stellen und in der richtigen Tiefe injiziert, um die Zellabgabe an das Bauchhorn des zervikalen Rückenmarks genau zu steuern. Der letzte Schritt besteht darin, dem Tier bis zur Tötung eine Immunsuppression zu verabreichen, um das Überleben der transplantierten Zellen im Rückenmark zu erreichen. Letztendlich können Ergebnisse für die Verfolgung des Überlebens, der Migration und der Differenzierung von transplantierten neuralen Vorläuferzellen im adulten zervikalen Rückenmark zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation durch histologische Methoden wie Immunhistochemie und anschließende mikroskopische Analyse erzielt werden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da viele der komplizierten Schritte der Rückenmarkschirurgie und der Zelltransplantation schwer zu erlernen sind, da sie große Sorgfalt und spezifische Techniken erfordern und erleichtert werden. Wenn diese empfohlenen Verfahren drei Tage vor der Transplantation angewendet werden, immunsuppressieren Sie das Tier durch tägliche Injektionen von 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, Cyclosporin A durch subkutane Injektion. Wenn von Nagetieren stammende Zellen transplantiert werden sollen, oder ein Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht von FK 5 0 6 und Rapamycin durch intraperitoneale Injektion.

Wenn Zellen menschlichen Ursprungs transplantiert werden sollen, formen Sie auch stabile Büroklammern zu Retraktoren. Brich einen Teil der Büroklammer ab, um einen Haken zu machen, und biege das andere Ende der Büroklammer zu einer kleinen Schlaufe. Binden Sie dann eine Schnur durch die Schlaufe jedes Retraktors, Autoklaven, der Retraktoren und aller Instrumente, die am Tag der Operation bei der Operation verwendet werden sollen.

Bereiten Sie Aliquots von glialen Vorläuferzellen oder anderen Zellen vor, die gemäß den im schriftlichen Protokoll beschriebenen Verfahren transplantiert werden sollen. Sobald die Zellen geerntet sind, verteilen Sie die Zellsuspensionen auf mehrere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie auf nassem Eis auf. Bestätigen Sie dann, nachdem Sie dem Tier eine geeignete Anästhesiemethode verabreicht haben, dass eine geeignete Anästhesieschuld für die Operation erreicht wurde, indem Sie eine Zehenklemme durchführen.

Mit einem Elektrorasierer rasieren Sie den Rücken des Tieres, rasieren Sie die Haare von einem leicht rostralen Bereich zu den Ohren bis zur Mitte des Rückens des Tieres gut und entfernen Sie die abgeschnittenen Haare von der Haut, um zu verhindern, dass Haare in den Schnitt gelangen. Als nächstes tränken Sie ein Stück Gaze mit Povidon-Jod-Antiseptikum und tragen Sie es auf die Haut über die rasierte Stelle auf. Schrubben Sie mindestens zweimal mit der antiseptischen Lösung und zweimal mit Alkohol oder verdünntem Desinfektionsmittel in kreisförmiger Weise.

Beginnend an der Schnittstelle nach außen in Richtung Haaransatz. Legen Sie ein steriles, gerolltes Mullkissen auf ein sauberes OP-Brett und kleben Sie das Pad so auf das Brett, dass es sich nicht bewegt. Legen Sie das Tier in einer Pflaumenposition auf die ausgerollte Gaze.

Strecken Sie beide Arme des Tieres auf dem Polster aus und kleben Sie die Arme dann an das Polster und die Operationsplatte, um das zervikale Rückenmark abzustützen. Dies erleichtert die Arbeit während der gesamten Operation, da sich das Halsmark tief unter der Hautoberfläche befindet. Bei diesem Eingriff muss ein steriles OP-Tuch verwendet werden, das jedoch zu Demonstrationszwecken nicht im Video zu sehen ist.

Sie durch ein Operationsmikroskop auf die niedrigste Vergrößerung schauen, verwenden Sie zunächst ein scharfes, steriles Skalpell, um einen Mittellinienschnitt von der Schädelbasis bis zum Schulterblatt vorzunehmen. Machen Sie dann einen Schnitt durch die drei Muskelschichten über der Wirbelsäule. Üben Sie genügend Druck aus, um alle Muskelschichten mit der minimalen Anzahl von Schnitten zu durchtrennen, aber drücken Sie nicht zu fest, da dies mit zwei Applikatoren mit Wattespitze zu Schäden in tieferen Geweben führen kann.

Trennen Sie mit einer Drehbewegung den darüber liegenden Muskel vom paraspinalen Muskel. Schneiden oder reißen Sie den Muskel nicht, da dies zu Blutungen führt. Platzieren Sie vier der selbstgebauten Retraktoren, um den Muskel zurückzuziehen.

Ziehen Sie dann jeden der vier Aufroller an alle vier Ecken und kleben Sie die Schnüre an das Brett, um den Aufroller zu sichern. Die endgültige Belichtung sollte quadratisch oder rechteckig sein. Verwenden Sie eine Zange mit Rattenzähnen und eine mittelgroße Federschere, um den Musculus paraspinalis von der dorsalen Oberfläche der Wirbel zu entfernen.

Nehmen Sie die Schnitte sehr nah am Knochen, um die Knochenoberfläche besser freizulegen. Achten Sie darauf, dass die Schnitte parallel zur Oberfläche der Wirbel verlaufen, aber nicht in die Nabelschnur einschneiden. Tauschen Sie die mittelgroße Federschere gegen eine Rohschere aus.

Sichern Sie dann die gesamte Wirbelsäule, indem Sie den Muskel über dem C 2-Prozess mit der Rattenzahnzange greifen und mit der rohen She den Muskel auf den Ebenen C vier, C fünf und C sechs wegziehen. Beginnen Sie dann mit einer Laminektomie bei C fünf. Sichern Sie den Bereich erneut, indem Sie C zwei mit einer Rattenzahnzange festhalten.

Fassen Sie die gesamte Lamina mit der rohen she und positionieren Sie die rohe Schar so, dass das Werkzeug vollständig senkrecht zur Achse der Wirbelsäule steht. Quetschen Sie die Lamina langsam und sanft, ohne sie in das Rückenmark zu drücken. Ziehe dann das gebrochene Knochenstück vorsichtig nach oben.

Positionieren Sie als Nächstes den Rohger senkrecht zur Wirbelsäule. Führen Sie dann den Rohger vorsichtig mit einem Winkel von 30 bis 60 Grad relativ zur Nabelschnuroberfläche unter den Knochen ein. Machen Sie kleine Schnitte, um die Laminektomie auf alle Schichten von C vier bis C sechs auszudehnen.

Dehnen Sie die Laminektomie nicht zu weit seitlich aus, da dies zu Blutungen führt. Erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops auf etwa 15-fach und fokussieren Sie sich auf das Kabel. Verwenden Sie gerade Schärfe.

Nummer fünf Pinzetten, um das Bindegewebe auf der Dura zu reinigen. Anschließend schneidest du die Dura entweder mit einer Mini-Federschere oder einem Mikromesser parallel zur Achse der Wirbelsäule ein. Als Punkt genau in der Nähe der Eintrittszone der dorsalen Wurzeln ist darauf zu achten, dass die Dura an der Stelle für die Injektion durchstochen wird.

Nach dem Piercen fließt die Dura zerebrale Rückenmarksflüssigkeit aus und trocknet die Oberfläche der Nabelschnur und die gesamte Belichtung mit Gaze oder einem Applikator mit Wattespitze. Greife die Dura mit einer Pinzette und hebe sie leicht vom Rückenmark weg, ohne das Rückenmark einzuklemmen oder zu verletzen. Verlängern Sie den Schnitt in der rostralen Herzachse leicht mit einer herausnehmbaren 10-Mikroliter-Nadelspritze vom Typ Hamilton Gast.

Ausgestattet mit einer scharfen 33 Gauge 45 Grad abgeschrägten Hamilton-Nadel aus Metall. Laden Sie langsam das erforderliche Volumen der Zellsuspension für eine Injektionsstelle. Senken Sie die Spitze der Nadel in Richtung der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks, während Sie den Fortschritt durch das Mikroskop überwachen.

Richten Sie die Spritze auf die Achse der Wirbelsäule aus, um die gewünschte anatomische Region richtig anzuvisieren, indem Sie die Nadel so nah wie möglich an 90 Grad und gerade medial zur Eintrittszone der dorsalen Wurzeln richten. Berühren Sie vorsichtig die Oberfläche des Rückenmarks mit der Nadelspitze und drücken Sie das Rückenmark mit der Nadelspitze leicht nach unten. Ziehen Sie dann die Nadel zurück, bis das Rückenmark wieder in die normale Position zurückkehrt.

Notieren Sie diese Position mit dem Lineal am Mikromanipulator als Z gleich 0,0. Während Sie den Fortschritt durch das Mikroskop visuell überwachen, senken Sie die Nadel leicht in das Rückenmark ab. Senken Sie die Nadel ab, um die 1,5 Millimeter so anzupassen, dass sie bei einer erwachsenen Ratte auf das Bauchhorn abzielen.

Lassen Sie die Nadel zwei bis fünf Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie mit der Injektion beginnen. Stellen Sie sicher, dass der chirurgische Aufbau während dieser Zeit ungestört bleibt. Injizieren Sie anschließend zwei Mikroliter Zellen über zwei bis fünf Minuten mit einer konstanten Geschwindigkeit mit der Pumpensteuerung nach der Injektion und lassen Sie die Nadel zwei bis fünf Minuten lang an Ort und Stelle.

Ziehen Sie dann die Nadel vorsichtig aus dem Rückenmark zurück. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang für andere Zielstellen. Sobald alle Zielstellen injiziert wurden, stellen Sie das Mikroskop wieder auf die niedrigste Vergrößerung und Naht.

Alle drei darüber liegenden Muskelschichten wurden gleichzeitig mit vier Nullnaht-Nahtmuskeln an drei Stellen in der rostralen Herzachse geschlossen. Heften Sie die Haut mit neun Millimeter langen Wundklammern zu, wobei Sie darauf achten, dass die Klammern einen Abstand von etwa 0,5 Zentimetern haben. Ziehen Sie die Klammern mit Nadelhaltern fest, um zu verhindern, dass das Tier die Klammern abzieht, bevor die Wunde vollständig verheilt ist.

Tragen Sie die antiseptische Povidon-IRD-Lösung mit getränkter Gaze auf den Bereich der Schnittwunde auf und lassen Sie das Tier auf einem zirkulierenden warmen Wasserkissen von der Narkose genesen. Fahren Sie mit Cyclosporin A oder FK 5 0 6 Rapamycin-Injektionen täglich fort, bis Opfer 50.000 Maus eingetroffen sind. Glio-Vorläuferzellen wurden in das Bauchhorn des Rückenmarks der Stufe C vier in einer SOD eins G 93 pro Ratte transplantiert.

Dieses Bild zeigt, dass M zwei positive Mäuse ankamen, transplantierte Zellen einen Monat nach der Transplantation überlebten und dass die Zellen in der ventralen grauen Substanz lokalisiert waren, aber die Injektionsstelle medial das laterale ventrale Horn verfehlte, wie durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet. Wie hier zu sehen ist, führt die Injektion einer viel höheren Anzahl von Zellen in diese Region zu einer Schädigung an der Injektionsstelle und entlang der Nadelbahn. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 45 bis 60 Minuten an sechs Injektionsstellen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.